3.1. Nghiên cứu phân lập và mô tả một số chủng vi khuẩn cố định nitơ cộng sinh cây đậu tƣơng Rhizobium sp. ở Thanh Trì và Thanh Hóa cây đậu tƣơng Rhizobium sp. ở Thanh Trì và Thanh Hóa
3.1.1. Phân lập chủng vi khuẩn cố định nitơ cộng sinh cây đậu tương tại khu vực Thanh Trì và Thanh Hóa Thanh Trì và Thanh Hóa
Các chủng Rhizobium được phân lập trên môi trường YEMA ở 28oC sau 48 giờ. Trên môi trường phân lập các chủng vi khuẩn nốt rễ Rhizobium được phân biệt với các lồi vi sinh vật khác bằng khả năng khơng hấp thụ congo đỏ, khuẩn lạc có màu trắng sữa, trịn, dính và có tạo chất nhầy ở các cấp độ khác nhau, các khuẩn lạc điển hình sau 3 - 7 ngày có kích thước khoảng 1-7 mm. Dựa trên các đặc điểm đó chúng tơi tuyển chọn các khuẩn lạc cho các chủng Rhizobium. Các khuẩn lạc tách được được ký hiệu và mô tả trên Bảng 3.1.
Bảng 3. 1. Các chủng vi khuẩn phân lập trên mơi trƣờng YEMA-CR tại Thanh Trì và Thanh Hóa
Ký hiệu Mơ tả hình thái khuẩn lạc trên mơi trƣờng phân lập TT2
Khuẩn lạc màu trắng cam, có hình cầu lồi, ướt, tạo vòng xung quanh, di động.
TT3 Khuẩn lạc trong, có hình cầu lồi, ướt, di động.
TT9 Khuẩn lạc màu trắng đục, có hình cầu lồi, di động, ướt.
TT10 Khuẩn lạc màu trắng bắt mầu hồng nhạt, có hình cầu tròn, phát
triển chậm (5 ngày).
TT11 Khuẩn lạc có viền đỏ nhân trắng, khơng cầu,khơng lồi, mặt sau đỏ,
không nhớt.
TT12 Khuẩn lạc màu trắng có hấp thụ congo nhẹ, có hình trịn, cầu lồi,
mặt sau có nhân đỏ viền trắng, khuẩn lạc khơng chảy nhớt.
TT14 Khuẩn lạc có màu trắng sữa, có hình cầu lồi, có khả năng tiết .các
chất nhày.
TT23 Khuẩn lạc trắng sữa hơi đục, chảy.
TT29 Khuẩn lạc trong, có hình cầu lồi, ướt, di động.
TT30 Khuẩn lạc trắng sữa hơi trong, chảy và nhớt
TH1 Mọc sau 4 ngày. 5 ngày kích thước rất nhỏ khơng đếm được. Sau
9 ngày có màu hồng nhạt, di động, bề mặt ướt (0,5-2mm).
TH3 Khuẩn lạc trong hơi hồng nhạt, có hình cầu lồi, ướt, di động.
TH4 Khuẩn lạc nhân trắng, viền trong bề mặt ướt, cầu.
TH7 Khuẩn lạc màu trắng hồng cam pha lẫn, có hình cầu lồi, di động.
TH8 Khuẩn lạc màu trắng, có hình cầu, ướt.
TH16
Khuẩn lạc màu trắng cam, có hình cầu lồi, ướt, tạo vòng xung quanh
Ghi chú: Vi khuẩn phân lập ở Thanh Trì ký hiệu là TT; vi khuẩn phân lập ở Thanh Hóa ký hiệu là TH
Hình 3. 2. Một số hình ảnh phân lập từ nốt sần đậu tƣơng ở Thanh Hóa
Dựa trên các đặc điểm nhận biết trên chúng tôi phân lập được 11 chủng vi khuẩn ở khu vực Thanh Trì và 6 chủng vi khuẩn ở khu vực Thanh Hóa phát triển trên mơi trường YEMA-CR có đặc điểm khuẩn lạc tương đối giống với chủng
Rhizobium sp. trong các tài liệu mô tả. Hai khuẩn lạc TT11 và TT12 khơng có độ nhày và bám dính đặc trưng của vi khuẩn Rhizobium xếp vào nhóm nghi ngờ.
3.1.2. Mơ tả một số đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn đã phân lập
Một số đặc điểm sinh hóa được khảo sát như nuôi cấy trên môi trường Hofer và Keto-lactose được tiến hành nhằm phân biệt các chủng vi khuẩn Rhizobium với các loài vi sinh vật khác. Rhizobium không mọc được trên môi trường kiềm cao
(hofer, pH11) và keto-lactose. Thử nghiệm trên môi trường YEM-BTB để xác định sự phát triển nhanh hay chậm của các chủng vi sinh vật, nếu phát triển nhanh thì
mơi trường ni cấy sẽ chuyển sang màu vàng, phát triển chậm mơi trường có màu xanh. Các chủng vi khuẩn được xác định trên các môi trường nuôi cấy sau 24 và 48 giờ. Kết quả đánh giá một số thử nghiệm sinh hóa được trình bày trên Bảng 3.2.
Bảng 3. 2. Một số đặc điểm sinh hóa các chủng vi khuẩn nốt sần đã phân lập tại Thanh Trì Tên chủng Đánh giá trên MT Hofer Đánh giá trên MT BTB Đánh giá trên MT Keto- lactose Nhuộm Gram Phát huỳnh quang TT2 - Xanh ánh vàng - Gr (-) không TT3 - Vàng + Gr (-) không TT9 - Xanh lam ánh vàng - Gr (-) không
TT10 - Xanh lam - Gr (-) không
TT11 - vàng - Gr (-) có
TT12 - vàng - Gr (-) có
TT14 - Vàng - Gr (-) không
TT15 - Xanh lam ánh
vàng - Gr (-) không
TT23 - xanh lam - Gr (-) không
TT29 - Xanh ánh vàng + Gr (-) không
TT30 - xanh lam - Gr (-) không
(-): không mọc hoặc khơng chuyển vàng; (+): có mọc
Hình 3. 3. Khả năng sinh trƣởng nhanh và tạo axit trên môi trƣờng YEM- BTB và MT Keto-lactose sau 48 giờ của vi khuẩn TT14
Các chủng phân lập đều không sinh trưởng được trên môi trường kiềm cao Hofer. Thử nghiệm keto-lactose cho thấy 9 chủng khơng tạo vịng màu vàng xung quanh khuẩn lạc và 2 dòng (TT3 và TT29) tạo vòng màu vàng xung quanh khuẩn lạc, chứng tỏ rằng 2 chủng vi khuẩn (TT3 và TT29) khơng thuộc nhóm
Rhizobium. Chủng TT11 và TT12 có khả năng phát huỳnh quang nên khơng
thuộc nhóm Rhizobium mà được nghi ngờ thuộc loài Pseudomonas. Bên cạnh đó, khi ni cấy trên mơi trường YEM-BTB dịch ni cấy của chủng TT11, TT12 và TT14 chuyển từ màu xanh sang màu vàng cho thấy nó có khả năng sinh trưởng nhanh, các chủng vi khuẩn Rhizobium cịn lại khơng thay đổi màu của dung dịch ni cấy là chủng có khả năng sinh trưởng chậm. Các chủng TT2, TT9, TT10, TT14, TT15, TT23, và TT30 đều có khả năng là vi khuẩn Rhizobium nên tiếp tục được tiến hành tách chiết DNA tổng số để định danh bằng phương pháp sinh học phân tử để đánh giá độ đa dạng.
Bảng 3. 3. Một số đặc điểm sinh hóa các chủng vi khuẩn nốt sần đã phân lập tại Thanh Hóa
STT Tên chủng Đánh giá trên MT Hofer Đánh giá trên MT BTB Đánh giá trên MT Keto-lactose 1 TH1 - xanh - 2 TH3 - xanh lá + 3 TH4 - Xanh ánh vàng - 4 TH7 - xanh lá - 5 TH8 - xanh lá - 6 TH16 - Xanh ánh vàng - (-): khơng mọc; (+): có mọc
Các chủng phân lập tại Thanh Hóa đều khơng sinh trưởng được trên môi trường kiềm cao Hofer. Thử nghiệm keto-lactose cho thấy trong 5 chủng vi khuẩn phân lập khơng tạo vịng màu vàng xung quanh khuẩn lạc và vi khuẩn TH3 tạo vòng màu vàng xung quanh khuẩn lạc, chứng tỏ rằng chủng vi khuẩn TH3 khơng thuộc nhóm Rhizobium. Bên cạnh đó, khi ni cấy trên mơi trường YEM-BTB dịch
ni cấy của các chủng kiểm tra các chủng vi khuẩn đều chuyển nhẹ mầu môi trường từ xanh đậm sang màu xanh ánh vàng cho thấy nó có khả năng sinh trưởng chậm. Các chủng TH1, TH4, TH7, TH8, TH16 đều có khả năng là vi khuẩn
Rhizobium nên tiếp tục được tiến hành tách chiết DNA tổng số để định danh bằng phương pháp sinh học phân tử để đánh giá độ đa dạng.
Các chủng phân lập được định danh theo kết quả phân tích trình tự gen 16S rDNA được thể hiện trên bảng 3.4.
Bảng 3. 4. Định danh các chủng phân lập
STT Tên chủng Tên chủng định danh
1 TT3 Rhizobium sp./ Agrobacterium tumefaciens
2 TT2 - 3 TT9 Sinorhizobium sp 4 TT10 - 5 TT11 và TT12 Pseudomonas flourencers 6 TT14 Sinorhizobium feddi 7 TT15 (TT18) Rhizobium sp 8 TT23 Rhizobium sp.
9 TT29 Rhizobium sp./Agrobacterium tumefaciens
10 TT30 Sinorhizobium sp.
11 TH1 Bradyrhizobium elkanii
12 TH3 Rhizobium sp./Agrobacterium tumefaciens
13 TH4 Rhizobium pusense
14 TH7 Aurantimonas sp
15 TH8 Sphingobacterium sp
16 TH16 -
Ghi chú: (-) chưa xác định
Kết quả phân loại cho thấy, các loài vi khuẩn cố định đạm xuất hiện trong nốt rễ cây đậu tương tại Thanh Hóa là các chi Bradyrhizobium, Rhizobium. Tại Hà Nội là các
Agrobacterium tumefaciens vi khuẩn nay có khả năng cố định đạm và tạo các u nốt cố
định giả trên cây đậu tương và có độ tương đồng trình tự khá cao với chi Rhizobium. Các chủng TH16, TT2 và TT10 chưa được định danh bằng phương pháp sinh học phân tử tuy nhiên dựa trên hình thái khuẩn lạc chúng tơi dự đốn thuộc chi Rhizobium.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi quan tâm đến các vi khuẩn Rhizobium có khả năng sinh trưởng nhanh nhằm mục đích tạo phân bón sinh học sau này và sử dụng làm chủng kiểm định cho đánh giá tác động của phân bón nano đến sinh trưởng và cố định đạm của chúng. Bên cạnh đó, chi Sinorhizobium là một chi cịn ít được nghiên cứu tại Việt Nam và chủng Sinorhizobium feddi TT14 đã được đánh giá là có khả năng sinh trưởng nhanh ở trên. Vì vậy, chủng Sinorhizobium feddi
TT14 được lựa chọn để tiến hành nghiên cứu tiếp theo.
3.1.3. Đặc điểm sinh học của chủng TT14 và phân tích trình tự gen 16S- rDNA
Đặc điểm của chủng TT14 được thể hiện cụ thể trên Bảng 3.1 và Hình 3.5a. hình thái khuẩn lạc có màu trắng sữa, có hình cầu lồi, có khả năng tiết các chất nhày. Sau 48 giờ ni cấy trên mơi trường YEMA-CR ở 28ºC, kích thước khuẩn lạc đạt 3-5 mm. Chủng TT14 không phát triển trên môi trường GPA.
Bảng 3. 4. Ảnh hƣởng của pH đến khả năng phát triển của chủng TT14 pH kiểm tra Khả năng phát triển
3 - 4 - 5 - 6 ++ 7 +++ 8 ++ 9 + 10 -
Ghi chú: “-”: không sinh trưởng; “+”: có sinh trưởng “++”: sinh trưởng bình thường; “+++”: sinh trưởng tốt.
Vi khuẩn TT14 phát triển trong khoảng pH từ 6 đến 9, phát triển tốt nhất ở pH 7. Không phát triển ở pH lớn hơn 9 và nhỏ hơn 6.
Bảng 3. 5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng phát triển của chủng TT14 Nhiệt độ kiểm tra, oC Khả năng phát triển
15 - 24 + 28 +++ 30 +++ 37 +++ 42 + 45 - 55 -
Ghi chú: “-”: không sinh trưởng; “+”: có sinh trưởng “++”: sinh trưởng bình thường; “+++”: sinh trưởng tốt.
Chủng TT14 phát triển trong dải pH 6,0 – 9,0 là mơi trường trung tính và có tính kiềm. Chủng TT14 có thể phát triển ở 24ºC đến 42ºC và phát triển mạnh nhất ở 37ºC, không phát triển ở nhiệt độ cao lớn hơn 45ºC. Kết quả nhiên cứu của chúng tôi phù hợp với những nghiên cứu trước đây (Ví dụ: Kucuk và cộng sự, 2006, đã phân lập được nhiều chủng có khả năng sinh trưởng tốt ở pH 6,0 – 9,0 và sinh trưởng tốt ở nhiệt độ cao 37 đến 45ºC).
Bảng 3. 6. Ảnh hƣởng của nồng độ muối đến sinh trƣởng của vi khuẩn TT14 Nồng độ muối, % Khả năng phát triển
0,01 +++ 0,1 +++ 0,5 +++ 1,0 ++ 1,5 ++ 2,0 +- 2,5 +- 5,0 - 10 -
Ghi chú: “-”: không sinh trưởng; “+-”: sinh trưởng yếu, “++”: sinh trưởng bình
thường; “+++”: sinh trưởng tốt.
Hình 3. 4. Chủng vi khuẩn TT14 phát triển trên các nồng độ muối khác nhau
Chủng vi khuẩn TT14 có khả năng phát triển trong dải nồng độ muối từ 0,01 đến 2,5%. Nồng độ muối trong môi trường cao sẽ làm giảm đáng kể khả năng cố định đạm và tạo nốt sần trong cây họ đậu, bằng cách giảm sự sinh trưởng của Rhizobia trong đất và vùng rễ. Cho đến nay, một số chủng Rhizobia phân lập được đã phát triển trong điều kiện muối cao (4-5%). Trong nghiên cứu của chúng tôi chủng TT14 sinh trưởng tốt ở nồng độ muối 0,01 – 0,5% và tốc độ sinh trưởng giảm
dần cho đến nồng độ muối 2,5%, ở nồng độ muối cao hơn chủng không phát triển. Theo Kucuk và cộng sự năm 2006, các chủng phân lập phát triển nhanh thường chịu được nồng độ muối cao hơn so với các dòng sinh trưởng chậm, chủng TT14 trong nghiên cứu của chúng tơi là chủng có khả năng sinh trưởng nhanh nên khả năng phát triển ở muối nồng độ cao 2,5% là hoàn toàn hợp lý.
Bảng 3. 7. Đặc điểm sinh học của chủng TT14
Thử nghiệm Đặc điểm
Khuẩn lạc Màu trắng sữa, có hình cầu lồi, có khả năng tiết các chất nhày, 3-5 mm
Nhuộm Gram Gr(-)
Nuôi cấy trên môi trường GPA Không phát triển
Tạo bào tử không
Tạo màng nhày xung quang tế bào Có
Khả năng chuyển hóa nitrate thành
nitrite +
Khả năng phân hủy gelatin -
Phát huỳnh quang không
Sinh polysaccharite ngoại bào 700 mg/L
Catalase + Khả năng sử dụng nguồn cacbon D-glucose L-arabinose D-xylose D-manitơl D-fructose D-cellulose sucrose khoáng + + - + + + + -
a b
Hình 3. 5. Khuẩn lạc chủng TT14 trên môi trƣờng YEMA-CR (a) và tế bào chủng TT14 bắt mầu Gram (-) (b) sau 24 giờ nuôi cấy
a b
Hình 3. 6. Khả năng chuyển hóa nitrat thành nitrit (a) và khơng chuyển hóa gelatin (b) của vi khuẩn TT14
Chủng TT14 có khả năng đồng hóa các nguồn đường: D-glucose, L- arabinose, D-manitol, D-fructose, D-cellulose, sucrose và khơng có khả năng đồng hóa D-xylose. Như vậy, phạm vi đồng hố các nguồn cacbon của chủng nghiên cứu tương đối đa dạng, đặc biệt chủng sử dụng tốt nguồn đường L-arabinose, là nguồn cacbon có sẵn trong hệ mạch dẫn của cây (N. Malfanova, B. Lugtenberg, G. Berg., 2013). Điều này chứng tỏ khả năng thích nghi tốt của chủng nghiên cứu, kể cả trong điều kiện đặc biệt như mô sống thực vật. Chủng TT14 có khả năng chuyển hóa nitrate thành nitrite và khơng sản xuất enzyme gelatinase trong môi trường nuôi cấy.
Hoạt tính gelatinase âm tính cũng là một đặc điểm của Rhizobium (Hunter et al.,
2007). Trên môi trường YEM chủng TT14 có khả năng sinh polysaccharite ngoại bào với hàm lượng đạt 264 mg/L.
Hình 3. 7. Tế bào TT14 (x 3000 lần) (trái) và (x 10000) (phải).
Quan sát dưới kính hiển vi điện tử với độ phóng đại 3000 và 10000 lần cho thấy tế bào vi khuẩn TT14 có dạng trực khuẩn, kích thc khong 0,5 ữ 1,5 àm, sinh mng nhy bao kín tế bào. Đây cũng là một đặc điểm quan trọng được nhiều tác giả mơ tả đối với nhóm Rhizobium (López-Baena et al., 2016; Sayyed et al.,
2011).
3.1.4. Phân tích trình tự gen 16S - rDNA của chủng TT14
DNA tổng số của các chủng phân lập được được tách chiết như đã trình bày trên phần phương pháp. Trên Hình 3.8 cho thấy, DNA tổng số tách được của chủng TT14 khá rõ nét và cho một băng rõ trên 10000 kb, gen thể hiện mức độ toàn vẹn của DNA tổng số. DNA tổng số được dùng làm khuôn để nhân gen 16S rRNA. Sản phẩm khuếch đại từ DNA tổng số của các chủng đều cho một băng rõ nét với cặp mồi 27f và 1492r có kích thước khoảng trên 1400 bp đúng với kích thước lý thuyết. Sản phẩm PCR được sử dụng để giải trình tự gen 16S –rDNA để phân loại chủng vi khuẩn lựa chọn.
Hình 3. 8. Điện di đồ sản phẩm PCR (1) và sản phẩm DNA tổng số (2) của TT14 trên gel agarose 1%. M: thang chuẩn DNA 1Kb (Norgen) Bảng 3. 8. Mức độ tƣơng đồng di truyền giữa chủng TT14 với các lồi vi
khuẩn có họ hàng gần dựa vào trình tự nucleotide của gen 16S rDNA
Gen 16S rDNA của chủng TT14 (1081 bp), có độ tương đồng cao (99%) với các gen tương ứng của một số loài thuộc chi Rhizobium như: Sinorhizobium fredii
R1 (AB639035), Sinorhizobium fredii S40 (EF506207) và Sinorhizobium sp MP1
(GQ355319). Kết hợp đặc điểm sinh học, đặc điểm hình thái và kết quả phân tích trình tự gen 16S rDNA cho thấy, chủng vi khuẩn TT14 có đặc điểm rất gần gũi và có độ tương đồng cao với lồi Sinorhizobium fredii nên chủng này được đặt tên là
Sinorhizobium fredii TT14. Chủng vi khuẩn so sánh Mã số truy cập trên GenBank Độ tƣơng đồng (%) S. fredii R1 AB639035 99 S. fredii S40 EF506207 99 Sinorhizobium sp MP1 GQ355319 99 S. fredii NGBSR8 AB825993 98 Sinorhizobium sp BBWH-W7 KJ472222 98 Sinorhizobium sp SCAUS114 KF836038 99
Theo một số nghiên cứu gần đây, chủng S. fredii là loài vi khuẩn cố định đạm được nghiên cứu nhiều do khả năng cố định đạm cao trên nhiều cây chủ khác nhau, sinh polysaccharite ngoại bào và có tiềm năng ứng dụng lớn trong tạo phân bón sinh