ỨNG DỤNG TRONG NHẬN DẠNG CÁ THỂ NGƯỜI
1.2.1. Cấu trúc đa dạng trong trình tự ADN có ý nghĩa trong nhận dạng cá thể:
Phân tử ADN có hai loại đa hình [23], gồm: - Đa hình theo trình tự
Các gốc nucleotit trong đoạn ADN được sắp xếp một cách ngẫu nhiên. Ví dụ: Tại locut A ta có trình tự:
Cá thể thứ nhất : - AGACTGCTAG - Cá thể thứ hai: - AGCCTGCGAG-
tại vị trí số 3 và vị trí số 8 của hai cá thể có sự khác nhau.
SNP (single nucleotide polymorphism) là một chỉ thị ADN có cấu trúc đa hình theo trình tự gần đây được nhiều nhà khoa học hình sự quan tâm chú ý. Hầu hết các SNP xuất hiện trong quần thể đều có hai alen (bi-allelic) và khác nhau chỉ 1 nucleotit. SNP phổ biến nhất trong quần thể là dạng đa hình C/T. Ngồi ra cũng xuất hiện dạng đa hình A/G, C/G.
Các chỉ thị SNP chiếm 90% trong số các đa hình di truyền ở người và cứ 500-1000 bazơ thì lại xuất hiện một SNP. Có hơn 3.000.000 SNP đã được biết đến thậm chí có ở tồn bộ bộ gen (genome) và tổng số các SNP trên genome người ước tính lên tới trên 10.000.000. Các SNP trên genome người có tỷ lệ đột biến rất thấp đồng thời cho các sản phẩm PCR có kích thước nhỏ chỉ từ khoảng 50 đến 150 bp. Điều này rất thuận lợi cho các ứng dụng để xác định huyết thống và nhận dạng nạn nhân trong các vụ thảm họa (khi mẫu ADN đã bị biến tính nghiêm trọng).
Tuy nhiên phần lớn các SNP chỉ có hai alen. Do vậy để đạt được khả năng phân biệt tới cá thể, cần thiết phải sử dụng số lượng lớn từ 50-80 locut. Hiện nay đã có rất nhiều nghiên cứu về SNP và tần suất alen của chúng ở các quần thể khác nhau nhằm ứng dụng trong nhận dạng cá thể [42, 43, 51, 52, 69, 84, 95, 105]. Tuy nhiên cần thiết phải có những nghiên cứu thêm về cơng nghệ để có thể sử dụng các SNP trong nhận dạng cá thể với chi phí thấp và thời gian phân tích ngắn.
- Đa hình theo chiều dài
Đa hình theo chiều dài do một số gốc nucleotit được lặp đi lặp lại nhiều lần trên chiều dài của đoạn ADN. Ví dụ:
Cá thể thứ nhất: - ATAT ATAT ATAT- 3 đoạn lặp ATAT. Cá thể thứ hai- ATAT ATAT ATAT ATAT - 4 đoạn lặp ATAT. Các locut hệ VNTR và STR là những locut chứa các gốc nucleotit lặp lại nhiều lần, thể hiện tính đa hình chiều dài đoạn. Ví dụ locut D5S818 là một locut thuộc hệ STR, gồm 4 nucleotit (AGAT) lặp đi lặp lại từ 6 đến 18 lần ở
các cá thể khác nhau [23]. Theo định luật di truyền từ locut có số lượng 13 alen này có thể tạo ra (13 x 14)/2 = 91 tổ hợp kiểu gen khác nhau. Tổ hợp nhiều locut khác nhau sẽ cho khả năng phân biệt cá thể càng cao.
1.2.2. Kü thuËt phân tích đa hình chiều dài đoạn ADN bằng enzym giíi h¹n
Kỹ thuật phân tích đa hình chiều dài đoạn bằng enzym giới hạn (hay còn gọi là kỹ thuật RFLP - Restriction Fragment Lengh Polymorphism) được Jeffreys phát triển từ năm 1985 [48] nhằm phân tích tính đa hình của các locut VNTR hay các đoạn minisattelite. Kỹ thuật này đòi hỏi phải cắt ADN genome bằng một enzym giới hạn (là enzym có khả năng nhận biết và cắt phân tử ADN ở một vị trí xác định). Sau đó người ta có thể phân tách các đoạn cắt khác nhau này theo kích thước của chúng nhờ kỹ thuật điện di trên gel agarose hoặc trên gel polyacrylamide, tiếp theo chuyển các đoạn ADN từ bản gel lên màng thẩm tích (Southern Blot) để thực hiện lai với các mẫu dò là các đoạn ADN đã đánh dấu phóng xạ hoặc đánh dấu bằng các chất huỳnh quang khác nhau. Vị trí nào có sự bắt cặp bổ sung với ADN mẫu dò sẽ được hiển thị bằng các băng tương ứng trên bản gel. Mỗi băng này tương ứng với một alen nên có thể được sử dụng để phân tích xác định cá thể.
Kỹ thuật này đã trë thµnh mét cơng cụ hữu hiệu trong xác định cá thể
thời đó. Tuy nhiên, kỹ thuật này cũng bộc lộ một số hạn chế vì nó địi hỏi ADN mẫu phải còn nguyên vẹn với một lượng tương đối lớn (≥50ng), đồng thời việc sử dụng các mẫu dị phóng xạ ảnh hưởng đến sức khỏe của kỹ thuật viên và gây ô nhiễm mơi trường. Kỹ thuật này cũng địi hỏi người thực hiện phải có tay nghề cao và q trình thao tác khó tự động hóa.
1.2.3. Phương pháp nhân bội ADN (PCR)
PCR là một phương pháp tổng hợp các trình tự ADN đặc hiệu trong ống nghiệm nhờ enzym được phát triển từ năm 1985 bởi Kary Mullis, ngày nay PCR là một kỹ thuật thơng dụng khơng thể thiếu được trong các phịng thí
nghiệm nghiên cứu y dược và sinh học. Nó có rất nhiều ứng dụng: nhân bội số lượng ADN cho giải trình tự, nghiên cứu sự phát sinh lồi, phân tích chức năng của gen, chẩn đoán bệnh di truyền, nhận dạng cá thể trong khoa học hình sự và các kiểm tra huyết thống. Bằng cơng trình này, năm 1993 Kary Mullis nhận được giải Nobel hóa học.
Trong quá trình PCR, phân tử ADN mới được tạo ra lại trở thành khuôn cho quá trình tái bản mới. Điều này khiến số lượng các phân tử ADN mới tạo thành tăng theo hàm mũ. Với kỹ thuật này, người ta có thể nhân bội một hay một vài bản sao của phân tử ADN thành hàng triệu bản sao trong một thời gian ngắn chỉ khoảng vài giờ.
Kỹ thuật PCR đã khắc phục được những nhược điểm của kỹ thuật RFLP bởi :
- Độ nhạy và tính đặc hiệu cao
- Khơng địi hỏi số lượng lớn ADN và thậm chí có thể sử dụng ADN đã bị biến tính một phần mà vẫn khơng ảnh hưởng tới độ chính xác của phân tích.
- Dễ tự động hóa trong các máy PCR chuyên dụng, cùng một lúc có thể kiểm tra nhiều locut.
1.2.4. Kỹ thuật PCR đa mồi (multiplex PCR)
PCR đa locut là một dạng khác của kỹ thuật PCR mà trong đó đoạn ADN đích được nhân bội cùng lúc bởi nhiều cặp mồi đặc hiệu cho nhiều locut khác nhau. Kỹ thuật này được áp dụng lần đầu vào năm 1988 [23]. Trong nhiều trường hợp khi một xét nghiệm ADN cần có kết quả phân tích của 2 hay nhiều locut khác nhau thì kỹ thuật PCR đa mồi giúp giảm chi phí về hóa chất, tiết kiệm đáng kể về thời gian và thao tác thí nghiệm. Bởi vậy, trong phân tích hình sự đối với các đoạn ADN đa hình, ngày nay hầu hết các phịng thí nghiệm ở các nước đều thực hiện tối ưu phản ứng PCR đa mồi cho các locut được lựa chọn. Năm 1994 bộ phức PCR đa mồi đầu tiên được phát triển
bởi Sở KHHS Anh bao gồm 4 locut TH01, FES/FPS, vWA, và F13A1. Cùng thời gian này, tập đoàn Promega cũng cho ra đời bộ kit thương mại đầu tiên có khả năng nhân bội đồng thời 3 locut CSF1PO, TPOX, và TH01 thường được gọi là bộ ba CTT (‘CTT’ triplex) [23].
Mục tiêu chính của PCR đa mồi là tối ưu được điều kiện cho tất cả các cặp mồi trong một phản ứng sao cho các sản phẩm PCR đều được nhân bội với số lượng nhiều nhất và dễ dàng nhận biết chúng bằng các phương pháp điện di. Bởi vậy, tỷ lệ các thành phần trong phản ứng PCR có ảnh hưởng rất lớn đến sản phẩm. Tuy nhiên, không phải lúc nào các sản phẩm PCR cũng hiện diện như mong muốn. Trong rất nhiều trường hợp, khi PCR đơn mồi thành công nhưng khi phối hợp đa mồi, một số locut khơng có sản phẩm PCR. Vì vậy, để xây dựng được quy trình PCR đa mồi phù hợp, một số tác giả đã đưa ra những hướng dẫn cụ thể [25, 72-74].
1.2.5. Kỹ thuật điện di
Cơ sở của kỹ thuật này là hiện tượng di chuyển của các phần tử tích điện như các phân đoạn ADN, ARN, hay các phân tử protein trong điện trường. Sự chuyển động của các phần tử phụ thuộc vào nhiều yếu tố trong đó có khối lượng và kích thước của phần tử. Trong trường hợp của những đoạn ADN có kích thước khác nhau sẽ có tốc độ chuyển động khác nhau trong điện trường, tạo nên những băng khác nhau trên gel điện di. Kỹ thuật này thường được sử dụng cho mục đích phân tích, song ở một số trường hợp nó được sử dụng như một kỹ thuật tiền đề để tiến hành các kỹ thuật khác như đo phổ khối, RFLP, PCR, giải trình tự ADN, hay kỹ thuật Southern blot để tìm hiểu các đặc tính chi tiết hơn của phân tử.
Trên thực tế, hai kỹ thuật điện di được sử dụng phổ biến trong các phòng thí nghiệm hiện nay là điện di trên gel agarose và điện di trên gel polyacrylamide.
Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide có những điểm nổi bật hơn so với gel agarose do:
- Khả năng phân tách tốt hơn, có khả năng phân biệt các đoạn có kích thước chênh lệch nhỏ thậm chí tới 1 base nitơ đối với các đoạn ADN.
- ADN tách chiết từ bản gel polyacrylamide rất tinh khiết và có thể được sử dụng vào nhiều mục đích khác nhau.
Sau khi q trình điện di hồn tất, các phân tử trên bản gel phải được nhuộm để có thể dễ dàng quan sát được. Có nhiều phương pháp nhuộm khác nhau, trong đó một số phương pháp cơ bản bao gồm:
- Nhuộm ethidium bromide (với phương pháp điện di trên gel agarose).
Nhuộm ethidium bromide có thể phát hiện băng ADN trên cả gel agarose và gel polyacrylamide. Trên cơ sở chất này có khả năng xen vào sợi kép ADN và hiện lên trên ảnh chụp khi chiếu tia UV. Ưu điểm của phương pháp này là nhanh chóng, ít tốn kém nên được sử dụng phổ biến. Song ethidium bromide là hóa chất có khả năng gây ung thư do vậy cần thận trọng khi sử dụng.
- Nhuộm bạc (điện di trên gel polyacrylamide).
Q trình nhuộm bạc bao gồm nhiều cơng đoạn, trong đó cả bản gel sẽ được nhuộm bằng nhiều hóa chất khác nhau. Những vị trí có ADN sẽ bắt cặp với bạc và được hiện trên bản gel. Tuy nhược điểm của phương pháp là phải thực hiện qua nhiều cơng đoạn khác nhau, song ưu điểm của nó là sử dụng các hóa chất ít độc hại hơn đồng thời độ nhạy với các trình tự ADN có kích thước nhỏ cũng cao hơn, có thể phát hiện được 15 pg/băng ADN nghĩa là gấp 60-70 lần so với phương pháp nhuộm ethidium bromide [96]. Bản gel sau khi được cố định có thể giữ được trong một thời gian dài, thậm chí có thể tách ADN từ các băng trên bản gel này để tiến hành tinh sạch và làm khuôn cho PCR [26].
- Sử dụng phương pháp nhuộm huỳnh quang.
Phương pháp này thường được sử dụng trong nhân bội các đoạn ADN đặc hiệu, trong đó các cặp mồi sử dụng trong PCR được gắn với chất phát quang [96]. Sản phẩm sau khi nhân bội được điện di trực tiếp trên máy đọc huỳnh quang tự động. Trên cơ sở đó, máy sẽ phát hiện được các băng ADN. Ưu điểm của phương pháp này là có khả năng phát hiện băng ADN với độ nhạy cao. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp là đòi hỏi thiết bị và hóa chất đồng bộ, giá trị của các máy đọc huỳnh quang tương đối cao.
- Sử dụng phương pháp đánh dấu phóng xạ.
Phương pháp này sử dụng các mồi hay các dNTP có gắn đồng vị phóng xạ P32 hay S35. Sau khi điện di, các băng được hiện bằng cách áp lên phim X quang dưới tác dụng của tia phóng xạ. Ưu điểm của phương pháp này có độ nhạy rất cao, nhưng nhược điểm của nó là cần nhiều trang thiết bị, hóa chất đồng thời có thể gây độc hại cho kỹ thuật viên [96].
1.2.6. Kỹ thuật giải trình tự
Để nghiên cứu các trình tự nucleotit trong một đoạn ADN chưa biết, người ta cần thực hiện giải trình tự. Giải trình tự là phương pháp đánh giá trực tiếp trình tự, số lượng nucleotit của một đoạn ADN, như vậy phương pháp này cho thông tin đầy đủ nhất về đoạn ADN cần đánh giá. Trong nghiên cứu hình sự, giải trình tự được thường thực hiện khi cần xác định kiểu gen (haplotype) trên ADN ty thể hay khi xác định đột biến có liên quan tới các alen đa hình STR, SNP hoặc xác định cấu trúc của một alen mới…[ 23, 32, 50, 64, 91, 94]
Hiện nay, giải trình tự được thực hiện chủ yếu dựa trên các thiết bị điện di mao quản do một số hãng sản xuất như ABI (Mỹ), Becman Counter (Đức) trên nguyên lý đọc huỳnh quang. Mỗi loại dideoxynucleotit được đánh dấu bằng một loại chất phát huỳnh quang màu khác nhau (xanh, lục, đỏ, vàng). Các đoạn ADN mang các nucleotit đánh dấu huỳnh quang khi chạy qua mao quản sẽ được quét bởi ánh sáng kích thích của tia lazer có trong thiết bị và tín
hiệu phát quang của mỗi loại nucleotit sẽ được thu nhận và phân tích bởi phần mềm riêng biệt.
Gần đây, song song với giải trình tự bằng kỹ thuật điện di mao quản, đã có những nghiên cứu mới về cơng nghệ giải trình tự để có thể nâng cao độ chính xác và hiệu suất phân tích. Nhiều tác giả đã và đang thử nghiệm ứng dụng phương pháp giải trình tự thế hệ mới (NGS, next generation sequencing) trong các lĩnh vực khác nhau như xác định đột biến, xác định bệnh, nghiên cứu giải trình tự bộ gen vi rut, vi khuẩn, phân tích ADN đa hình cho nhận dạng cá thể…. [37, 58, 63, 82, 99, 105]. Công nghệ mới cho phép phân tích đồng thời hàng trăm locut STR trên cả nhiễm sắc thể thường và nhiễm sắc thể giới tính [28, 82, 83, 93, 106, 107]. Cơng nghệ NGS được thực hiện dựa trên nguyên lý tổng hợp trực tiếp đồng thời với việc thu thập dữ liệu hình ảnh.
Hiện nay một số thiết bị giải trình tự đang bước đầu được ứng dụng thử nghiệm ở các nước khác nhau ở Việt Nam, có thể kể đến như hệ thống giải trình tự Ion Torrent của ABI, MySeq, HiSeq … của Illumina (Mỹ).