3.1. THIẾT KẾ MỒI VÀ LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN PCR THÍCH HỢP CHO PHỨC 4 LOCUT F13A01, D8S1179, AMELOGENIN, HPRTB CHO PHỨC 4 LOCUT F13A01, D8S1179, AMELOGENIN, HPRTB (FDAH)
Sử dụng phần mềm Primer Premier 5 và căn cứ vào cỏc tiờu chớ đó xỏc định (mục 2.3.1), chỳng tụi đó thiết kế được cỏc cặp mồi cho 4 locut F13A01, D8S1179 và HPRTB và Amelogenin.
3.1.1. Thiết kế mồi cho locut F13A01:
Xỏc định khoảng kớch thước sản phẩm PCR cho locut F13A01 là từ 280 đến 350 bp, sau khi trớch xuất trỡnh tự ADN của locut, đưa vào phần mềm thiết kế mồi, chỳng tụi thu được 04 phương ỏn cho trỡnh tự mồi như sau:
Phương ỏn 1:
F13A1 F1: 5’ - GGTAAAGCCCCATCTCTACTAA - 3’ F13A1 R1: 5’ - GAAAATAACACTTGGTTTTCTCTG - 3’ Phương ỏn 2:
F13A1 F2: 5’ - GCA TGC ACC TGT AGT TCC AG - 3’ F13A1 R2: 5’ - TAG CCC CAA GGA AGA TGA GT - 3’ Phương ỏn 3: F13A1 F3: 5’ - GGCATGCACCTGTAGTTCCAGC- 3’ F13A1 R3: 5’ - AGCCCCAAGGAAGATGAGTAAACA- 3’ Phương ỏn 4: F13A1 F4: 5’ - GGCATGCACCTGTAGTTCCA- 3’ F13A1 R4: 5’ - AGCCCCAAGGAAGATGAGT- 3’
Qua phõn tớch cỏc thụng số bỏo cỏo từ phần mềm thiết kế cho mỗi mồi (Phụ lục 2a), chỳng tụi thấy phương ỏn 1 cú một số hạn chế như %GC ở mồi xuụi quỏ thấp (33.3%), xuất hiện dimer, hairpin. Phương ỏn 2 khụng sử dụng được vỡ lỗi hairpin ở đầu 3’. Phương ỏn 3 và 4 đỏp ứng phần lớn cỏc tiờu chớ đặt ra. Phương ỏn 4 cú hiện tượng tạo dimer và cross dimer, tuy nhiờn bắt cặp
mồi khụng xảy ra ở đầu 3’. Do vậy chỳng tụi lựa chọn 02 cặp mồi của phương ỏn 3 và 4 sử dụng để phối hợp sàng lọc multiplex.
3.1.2. Thiết kế mồi cho locut D8S1179:
Xỏc định khoảng kớch thước sản phẩm PCR cho locut D8S1179 là từ 230 đến 270 bp, sau khi trớch xuất trỡnh tự ADN của locut, đưa vào phần mềm thiết kế mồi, chỳng tụi thu được 04 phương ỏn cho trỡnh tự mồi như sau:
Phương ỏn 1:
D8S1179 F1: 5’ - GCC AGA AAC CTC TGT AGC CA- 3’ D8S1179 R1: 5’ - ATC GTA TCC CAT TGC GTG AA- 3’ Phương ỏn 2:
D8S1179 F2: 5’ - CCA GAA ACC TCT GTA GCC AG- 3’ D8S1179 R2: 5’ - TAT CGT ATC CCA TTG CGT GA- 3’ Phương ỏn 3: D8S1179 F3: 5’ - AGAAACCTCTGTAGCCAGTGG- 3’ D8S1179 R3: 5’ - TGTATCGTATCCCATTGCGT - 3’ Phương ỏn 4: D8S1179 F4: 5’ - GGCCAGAAACCTCTGTAGCC - 3’ D8S1179 R4: 5’ - TCGTATCCCATTGCGTGAA - 3’
Bỏo cỏo thụng số thiết kế cho từng cặp mồi được nờu tại Phụ lục 2b. Cỏc cặp mồi của phương ỏn 3 và phương ỏn 4 đều cú hiện tượng tạo cấu trỳc dạng cặp túc (hairpin) và hiện tượng tự bắt cặp của mồi (dimer) ở đầu 3’.
Phương ỏn 1, 2 đỏp ứng cỏc tiờu chớ đặt ra, được lựa chọn để phối hợp sàng lọc multiplex.
3.1.3. Thiết kế mồi cho locut HPRTB:
Xỏc định khoảng kớch thước sản phẩm PCR cho locut HPRTB là từ 150 đến 200 bp, sau khi trớch xuất trỡnh tự ADN của locut, đưa vào phần mềm thiết kế mồi, chỳng tụi thu được 05 phương ỏn cho trỡnh tự mồi như sau:
Phương ỏn 1:
HPRTB F1: 5’ - TTC CAT CTC TGT CTC CAT CTT TG - 3’ HPRTB R1: 5’ - ACA CAT CCC CAT TCC TGC C - 3’
Phương ỏn 2:
HPRTB F2: 5’ - TTC CAT CTC TGT CTC CAT CTT - 3’ HPRTB R2: 5’ - CAT CCC CAT TCC TGC CAA- 3’ Phương ỏn 3:
HPRTB F3: 5’ - TCT ATT TCC ATC TCT GTC TCC A- 3’ HPRTB R3: 5’ - TCC CCA TTC CTG CCA AAT- 3’
Phương ỏn 4:
HPRTB F4: 5’ - TTG ATG TTG ACA CTA GTT TAC CTA G- 3’ HPRTB R4: 5’ - TTC AAT AAA TAG GAG AAG GGC AT- 3’ Phương ỏn 5:
HPRTB F5: 5’ - TTG ATG TTG ACA CTA GTT TAC CTA GA- 3’ HPRTB R5: 5’ - TTC AAT AAA TAG GAG AAG GGC A- 3’ Bỏo cỏo thụng số thiết kế cho từng cặp mồi được nờu tại Phụ lục 2c. Cặp mồi của phương ỏn 1 đỏp ứng cỏc tiờu chớ đặt ra.
Cặp mồi của phương ỏn 2 cú nhiệt độ núng chảy của mồi xuụi thấp (53,4oC), sự chờnh lệch về nhiệt độ Tm giữa hai mồi lớn (6oC).
Cặp mồi của phương ỏn 3 cũng cú nhiệt độ núng chảy của mồi xuụi thấp (54oC), tuy nhiờn khụng cú cỏc lỗi khỏc như bắt cặp dimer hay hairpin…. Cặp mồi của phương ỏn 4 cú nhiệt độ núng chảy của mồi xuụi thấp (53,7oC), cú hiện tượng bắt cặp dimer và cross dimer hầu hết ở đầu 3’.
Cặp mồi của phương ỏn 5 cho tỷ lệ % GC thấp (34,6% đối với mồi xuụi và 36,4% đối với mồi ngược), đồng thời cú hiện tượng tạo cấu trỳc cặp túc (hairpin) và cấu trỳc cross dimer ở nhiều điểm.
Từ kết quả trờn, chỳng tụi lựa chọn cặp mồi của phương ỏn 1 và 3 để phối hợp sàng lọc multiplex.
3.1.4. Lựa chọn mồi cho locut Amelogenin:
Kớch thước sản phẩm PCR xỏc định cho locut Amelogenin là 210 đến 220bp. Căn cứ vào yờu cầu về kớch thước sản phẩm PCR, sau khi tham khảo cỏc cặp mồi thiết kế cho locut Amelogenin đó cụng bố [23, 109], chỳng tụi
lựa chọn cặp mồi của hóng Promega. Cặp mồi cho phộp nhõn bội trỡnh tự locut Amelogenin với kớch thước 212bp trờn NST X và 218 bp trờn NST Y (phụ lục 1d). Trỡnh tự của cặp mồi như sau:
Amel F 5'- ACC TCA TCC TGG GCA CCC TGG-3' Amel R 5'- AGG CTT GAG GCC AAC CAT CAG -3' 3.1.5. Sàng lọc multiplex
Sau khi đó lựa chọn được cỏc cặp mồi đạt yờu cầu đối với mỗi locut, chỳng tụi tiếp tục đưa cỏc cặp mồi lựa chọn được vào phần mềm thiết kế để tiếp tục sàng lọc nhằm lựa chọn phương ỏn tối ưu.
Cú 7 cặp mồi được đưa vào sàng lọc multiplex, bao gồm : - 02 cặp mồi cho locut F13A01 :
F13A1 F3: 5’ - GGCATGCACCTGTAGTTCCAGC- 3’ F13A1 R3: 5’ - AGCCCCAAGGAAGATGAGTAAACA- 3’
F13A1 F4: 5’ - GGCATGCACCTGTAGTTCCA- 3’ F13A1 R4: 5’ - AGCCCCAAGGAAGATGAGT- 3’ - 02 cặp mồi cho locut D8S1179
D8S1179 F1: 5’ - GCC AGA AAC CTC TGT AGC CA- 3’ D8S1179 R1: 5’ - ATC GTA TCC CAT TGC GTG AA- 3’
D8S1179 F2: 5’ - CCA GAA ACC TCT GTA GCC AG- 3’ D8S1179 R2: 5’ - TAT CGT ATC CCA TTG CGT GA- 3’ - 01 cặp mồi cho locut Amelogenin
Amel F 5'- ACC TCA TCC TGG GCA CCC TGG-3' Amel R 5'- AGG CTT GAG GCC AAC CAT CAG -3' - 02 cặp mồi cho locut HPRTB
HPRTB F1: 5’ - TTC CAT CTC TGT CTC CAT CTT TG - 3’ HPRTB R1: 5’ - ACA CAT CCC CAT TCC TGC C - 3’
HPRTB F3: 5’ - TCT ATT TCC ATC TCT GTC TCC A- 3’ HPRTB R3: 5’ - TCC CCA TTC CTG CCA AAT- 3’
Tổ hợp multiplex được lựa chọn qua việc xem xột khả năng xảy ra sự bắt cặp chộo (cross dimer) đối với 4 cặp mồi tương ứng với 4 locut, đặc biệt ở vị trớ đầu 3’. Tổ hợp xuất hiện những bắt cặp ở đầu 3’ sẽ khụng được lựa chọn cho multiplex.
Kết quả cuối cựng, chỳng tụi đó lựa chọn được cỏc cặp mồi sau :
Bảng 3.1. Trình tự và thơng số các cặp mồi của 4 locut F13A01, D8S1179, HPRTB và Amelogenin
Locut Loại mồi Trỡnh tự mồi Tm (0C) Kớch thước sản phẩm PCR (bp)
F 5’ - GGC ATG CAC CTG TAG TTC CA- 3’ 59.0
F13A01
R 5’ - AGC CCC AAG GAA GAT GAG T- 3’ 55.8
279 – 335 (alen 3 – 17) (alen 3 – 17)
F 5’ - GCC AGA AAC CTC TGT AGC CA- 3’ 57.7
D8S1179
R 5’ - ATC GTA TCC CAT TGC GTG AA- 3’ 58.7
227 – 271 (alen 9 – 20) (alen 9 – 20)
F 5'- ACC TCA TCC TGG GCA CCC TGG-3' 60,9
Amelogenin
R 5'- AGG CTT GAG GCC AAC CAT CAG -3' 61,5 212- 218
F 5’ - TTC CAT CTC TGT CTC CAT CTT TG - 3’ 58.6
HPRTB
R 5’ - ACA CAT CCC CAT TCC TGC C - 3’ 59.9
159 – 203 (alen 7 – 18) (alen 7 – 18)
3.1.6. Lựa chọn điều kiện PCR thớch hợp cho phức 4 locut F13A01, D8S1179, HPRTB và Amelogenin
Một trong những mục tiờu của luận ỏn là thiết kế mồi cho 4 locut F13A01, D8S1179, HPRTB và Amelogenin để phõn tỏch trờn gel polyacrylamid biến tớnh cú ure. Đõy là loại gel cú khả năng phõn tỏch cao, cú thể cho phộp phõn biệt cỏc đoạn ADN cú kớch thước chờnh lệch nhỏ, thậm chớ tới 1 bazơ nitơ [23, 96].
Trong luận ỏn này, với cỏc locut đơn, để xỏc định độ đặc hiệu mồi cũng như khoảng kớch thước sản phẩm PCR, chỳng tụi sử dụng gel agarose để phõn tớch. Với phức 4 locut, việc kiểm tra sản phẩm PCR trong quỏ trỡnh thử nghiệm cần thực hiện trờn gel polyacrylamide biến tớnh để cú thể xỏc định rừ sự phõn tỏch sản phẩm PCR giữa cỏc locut.
3.1.6.1. Kết quả PCR kiểm tra cỏc cặp mồi 4 locut:
Với cỏc cặp mồi đó thiết kế và lựa chọn, chỳng tụi đó tiến hành phản ứng PCR cho từng cặp mồi tương ứng với 4 locut, thành phần và chu trỡnh
nhiệt được xỏc định trờn cơ sở tham khảo thành phần và chu trỡnh nhiệt cơ sở của Buttler [23] đối với cỏc locut STR. Kết quả thu được như sau:
- Thành phần: dNTP 200M; MgCl2 1mM; đệm phản ứng 1X; ADN
khuụn (K562) 0,5 ng; Taq DNA-polymerase 1U; mồi 0,2M.
- Chu trỡnh nhiệt: 95oC - 5 phỳt; (94oC -1 phỳt; 60oC -1 phỳt; 72oC - 1 phỳt) x 35 chu kỳ; 72oC - 10 phỳt.
Kết quả kiểm tra cỏc cặp mồi được thể hiện ở hỡnh 3.1 và 3.2.
Hỡnh 3.1. Hỡnh ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm tra cặp mồi locut F13A01 và D8S1179
(1, 2: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi locut F13A01; 3, 4: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi locut D8S1179; M50: marker 50bp; ĐC (-): mẫu đối chứng õm)
Hỡnh 3.2. Hỡnh ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm tra cặp mồi locut Amelogenin và HPRTB
(1, 2: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi locut Amelogenin; 3, 4: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi locut HPRTB; M50: marker 50; ĐC (-) : mẫu đối chứng õm PCR)
1 2 M50 3 4 M50 ĐC (-) (-) 250bp 1 2 M50 3 4 M50 ĐC (-) 200bp