1.5.1. Các locut STR
Hiện nay, theo thống kê của Viện Tiêu chuẩn và Công nghệ quốc gia NIST - Mỹ, (National Institute of Standard and Technology) có khoảng 55 locut STR được sử dụng phổ biến trong nhận dạng cá thể, trong đó có 29 locut trên nhiễm sắc thể thường và 26 locut trên nhiễm sắc thể giới tính. Thơng tin về các locut nghiên cứu luôn được cập nhật đầy đủ, thường xuyên tại địa chỉ http://www.cstl.nist.gov/strbase [23, 109].
Các locut chúng tôi lựa chọn nghiên cứu nằm trong số các locut nêu trên, trong đó có 10 locut thuộc hệ CODIS (hệ các locut chủ đạo của FBI, Mỹ). Việc lựa chọn nghiên cứu và ứng dụng các locut này ở quần thể người Việt là cơ sở để khi cần có thể so sánh, trao đổi dữ liệu phân tích với dữ liệu của các phịng thí nghiệm trong nước và trên thế giới. Đồng thời, để phù hợp với công nghệ điện di nhuộm bạc, ngồi những tiêu chí lựa chọn chung cho một locut STR như có kích thước đơn vị lặp 4 nucleotit, nằm ở các vị trí riêng biệt trên
các nhiễm sắc thể hoặc nằm trên nhiễm sắc thể riêng rẽ, có khả năng phối hợp tốt với nhau trong cùng phản ứng nhân bội multiplex… [23], các locut chúng tơi lựa chọn cần có số lượng alen vừa phải để có thể đảm bảo phân tích được đầy đủ tất cả các alen trên cùng một bản gel. Số lượng alen phù hợp khoảng từ 6 đến 15 alen cho một locut. Như vậy, khi tạo thang alen phối hợp cho 3 locut, sẽ có tổ hợp thang alen chuẩn với số lượng vừa phải để có thể đọc được trên cùng một bản gel. Ví dụ các locut như CSF1PO, TH01, TPOX… là các locut có số lượng alen từ 11 - 13 alen [16, 17, 23, 72-74, 109], phù hợp với yêu cầu trên. Các locut như FGA, Penta D, Penta E… là các locut có số lượng alen lớn từ 40 đến 98 alen [16, 17, 23, 72-74, 109]. Việc đọc số lượng lớn các alen như vậy không thể thực hiện được trên một bản gel.
Trên cơ sở tham khảo thông tin về các locut STR được sử dụng phổ biến trong nhận dạng cá thể và trên cơ sở các yêu cầu đặt ra, chúng tôi đã lựa chọn nghiên cứu 15 locut STR: D5S818, D7S820, D13S317, CSF1PO, TH01, TPOX, D16S539, D3S1358, vWA, F13B, FES/FPS, LPL, F13A01, D8S1179 và HPRTB. Các locut lựa chọn được sắp xếp theo 5 tổ hợp để tạo các bộ kit nhân bội ADN phức 3 locut. 5 tổ hợp bao gồm (1) D5S818-D7S820- D13S317; (2) CSF1PO-TH01-TPOX; (3) D16S539-D3S1358-vWA, (4) F13B-FES/FPS-LPL và (5) F13A01-D8S1179-HPRTB-Amelogenin. Các tổ hợp (1 - 4) đã được tối ưu trong những nghiên cứu trước đây [2-5]. Tổ hợp 4 locut F13A01-D8S1179-HPRTB và Amelogenin chưa được nghiên cứu ở Việt Nam trước đây nên được nghiên cứu trong luận án này. Đồng thời trên cơ sở những kết quả nghiên cứu trước, chúng tôi cũng thực hiện khảo sát tần suất alen và đánh giá tính đa hình cho tổ hợp 15 locut (D5S818, D7S820, D13S317, CSF1PO, TH01, TPOX, D16S539, D3S1358, vWA, F13B, FES/FPS, LPL, F13A01; D8S1179 và HPRTB) ở quần thể người Việt (Kinh).
Đặc điểm các locut nghiên cứu trong luận án được trình bày tại bảng 1.4.
Bảng 1.4. Đặc điểm của 15 locut STR sử dụng trong nghiên cứu [23, 25, 109] STT Tên locut Vị trí trên NST Trình tự đơn vị lặp Mã Genbank Alen 1. D5S818 5q23.2 AGAT G08446 7 18 2. D7S820 7q21.11 GATA G08616 5 16 3. D13S317 13q31.1 TATC G09017 5 16 4. CSF1PO 5q33.1 TAGA X14720 5 16 5. TPOX 2p25.3 GAAT M68651 4 16 6. TH01 11p15.5 TCAT D00269 3 14 7. D16S539 16q24.1 GATA G07925 5 16 8. D3S1358 3p21.31 [TCTG][TCTA] NT_005997 8 21 9. vWA 12p13.31 [TCTG][TCTA] M25858 10 25 10. F13B 1q31-q31.2 TTTA M64554 6 12
11. FES/FPS 15q25-qter ATTT X06292 7 14
12. LPL 8p22 TTTA D83550 7 14 13. D8S1179 8q24.13 [TCTA][TCTG] G08710, AF216671 7 20 14. F13A01 6p24.3-25.1 GAAA M211986 3.2 16 15. HPRTB Xq26.1 TCTA M26434 6 17 1.5.2. Locut Amelogenin
Amelogenin là locut nằm trên NST giới tính X (vị trí Xp22.1) và Y (vị trí Yp11.2), có mã genbank là M55418 và M55419 [109]. Locut này thường được sử dụng kết hợp với các locut STR trong các bộ KIT thương mại nhằm xác định giới tính cá thể.
Các cặp mồi sử dụng trong các bộ KIT thương mại cho phép nhân bội trình tự ADN trên cả hai NST X và Y. Cặp mồi của hãng Promega cho sản phẩm PCR là đoạn trình tự 212bp trên NST X và 218 bp trên NST Y, cặp mồi của British cho sản phẩm PCR là đoạn trình tự 106bp trên NST X và 112 bp trên NST Y. Một số cặp mồi khác cho sản phẩm PCR với kích thước chênh lệch gần 200 bp giữa trình tự thu được trên X và Y nhằm phân tích trên gel agarose…[23, 109].