CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIấN CỨU 2.1.1. Mẫu sinh phẩm

Mẫu nghiờn cứu được thu ngẫu nhiờn trong phạm vi đề tài phối hợp với cụng an Thành phố Hải Phũng. Số lượng bao gồm 250 mẫu mỏu của cỏc cỏ thể người Việt (Kinh) khỏe mạnh (trong đú cú 202 nam, 48 nữ). Cỏc mẫu được lưu giữ trờn thẻ bảo quản mẫu tại -20oC.

Theo nghiờn cứu của Chakraborty [29], lượng mẫu cần thiết để để cú thể đại diện cho một quần thể trong nghiờn cứu tần suất phõn bố alen của cỏc locut STR là 100 - 150 cỏ thể. Nhiều cụng trỡnh khỏc thường cú cỡ mẫu từ 100 đến 300 cỏ thể [41, 57, 89]. Cỡ mẫu của chỳng tụi đảm bảo đủ cho nghiờn cứu và cho việc khảo sỏt, phỏt hiện thờm cỏc alen mới ở quần thể người Việt (Kinh).

2.1.2. Cỏc locut đa hỡnh STR và locut giới tớnh Amelogenin

15 locut gen đa hỡnh STR được lựa chọn dựa trờn cỏc tiờu chớ đó nờu (mục 1.5) bao gồm: locut D5S818, D7S820, D13S317, CSF1PO, TPOX, TH01, D3S1358, D16S539, vWA, F13A01, D8S1179, HPRTB, F13B, FES/FPS, LPL và 01 locut xỏc định giới tớnh Amelogenin .

2.2. THIẾT BỊ VÀ HểA CHẤT 2.2.1. Thiết bị

Bộ điện di (Bio-Rad - Mỹ); Đốn soi UV (BioRad - Mỹ); Mỏy li tõm (Sorvall - Mỹ); Lũ vi súng (Nhật); Tủ lạnh (Nhật); Tủ hốt hoỏ chất (Đức); Tủ hốt vụ trựng (Đức); Mỏy khuấy từ (Bio-Rad - Mỹ); Mỏy định lượng ADN (GeneQuant-Pro - Anh); Mỏy lắc (Nhật); Mỏy ổn nhiệt (Grant - Anh); Mỏy PCR Gradient Icycler (Bio Rrad - Mỹ); mỏy giải trỡnh tự 3130 Genetic Analyzer (ABI - Mỹ); Bộ pipetman (Gilson – Phỏp).

2.2.2. Húa chất

2.2.2.1. Hóa chất tách chiết ADN

- PBS (Phosphate buffer saline) 137 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 10 mM Na2HPO4; 2 mM KH2PO4.

- Chelex 100 ( Sigma-Mỹ)

2.2.2.2. Hoỏ chất dựng cho PCR

- Đối với 4 locut F13A01, D8S1179, HPRTB và Amelogenin, sử dụng cỏc húa chất sau:

+ Đệm 10X PCR; 25 mM MgCl2; Taq-ADN polymerase (5unit/l); hỗn hợp dNTP 5mM (Invitrogen);

+ Mồi của 04 locut F13A01, D8S1179; HPRTB và Amelogenin đặt tại hóng IDT (Mỹ).

+ Nước khử ion vụ trựng dựng cho PCR.

- Đối với cỏc locut D5S818, D7S820, D13S317; CSF1PO, TPOX, TH01; D3S1357, D16S539, vWA; F13B; FES/FPS; LPL : Sử dụng cỏc bộ KIT nhõn bội ADN 3D, CTT, DDW và FFL chế tạo theo cỏc nghiờn cứu trước đõy [2-5].

+ Bộ KIT 3D: Nhõn bội đồng thời cỏc locut đa hỡnh D5S818, D7S820, D13S317.

+ Bộ KIT CTT: Nhõn bội đồng thời cỏc locut đa hỡnh CSF1PO, TPOX và TH01.

+ Bộ KIT DDW: Nhõn bội đồng thời cỏc locut đa hỡnh D3S1357, D16S539, vWA

+ Bộ KIT FFL: Nhõn bội đồng thời cỏc locut đa hỡnh FES/FPS, F13B và LPL.

+ Thành phần mỗi bộ KIT (dựng cho 30 phản ứng) gồm: Master Mix (400l); nước PCR (1,5ml); Taq ADN-polymerase (15l, 5U/1l); ADN đối chứng (20l, 10ng/l); thang alen (60l).

+ Thang alen chỉ thị cỏc locut được xỏc định trong cỏc bộ kit như sau: Locut D5S818, D7S820 và CSF1PO đều gồm 8 alen (alen số 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14); locut D13S317 và FES/FPS đều gồm 8 alen (alen số 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15); locut TPOX gồm 6 alen (alen số 7, 8, 9, 10, 11, 12); locut TH01 gồm 7 alen (alen số 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11); locut D16S539 gồm 7 alen (alen số 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15); locut D3S1358 gồm 9 alen (alen số 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20); locut vWA gồm 9 alen (alen số 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21); locut F13B gồm 6 alen (alen số 6, 7, 8, 9, 10, 11); locut LPL gồm 6 alen (alen số 7, 9, 10, 11, 12, 13).

2.2.2.3. Húa chất dựng cho điện di

- Đệm TBE 1X

- Agrose ( Invitrogen - Mỹ).

- Acrylamide (Pharmacia - Thuỵ Điển) - Bis-acrylamide (Pharmacia - Thuỵ Điển) - APS (Sigma - Mỹ)

- TEMED (Bio-Rad - Mỹ) - Urea (Merck - Đức)

- Đệm trộn mẫu (Formamide 80%; Bromophenol Blue 0,25%; xylene cyanol FF 0,25%) - BioRad (Mỹ).

- Marker 50bp (Fermentas, Mỹ), Marker 20bp (Lonza, Mỹ) - Mẫu chuẩn K562 (Promega, Mỹ)

2.2.2.4. Húa chất dựng cho nhuộm gel

- Nhuộm gel agarose: Ethidium bromide (10 mg/ml) (Invitrogen). - Nhuộm bạc gel polyacrylamide: Acetic acid; Nitrate bạc; Sodium

carbonate; NaOH; Formaldehyde (Merck - Đức); Sodium thiosulphate (Na2S2O3) (Sigma- Mỹ).

2.2.2.5. Húa chất dựng cho giải trỡnh tự

- BigDye Terminator v3.1 (ABI PRISMđ - Mỹ) - Seq POP4 (ABI PRISMđ - Mỹ)

- Hidifomamide (ABI PRISMđ - Mỹ)

2.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU 2.3.1. Thiết kế mồi

Trong luận ỏn, chỳng tụi tiến hành thiết kế mồi nhằm nhõn bội đồng thời 4 locut : F13A01, D8S1179, Amelogenin và HPRTB. Vỡ vậy, mỗi mồi thiết kế cần phải đỏp ứng cỏc tiờu chớ sau [23, 103]

- Chiều dài mồi : từ 18 - 30 bp - Nhiệt độ núng chảy: 52 - 62oC - Tỷ lệ phần trăm GC: 40 - 60%

- Khụng cú hiện tượng tự bắt cặp của mồi (tạo cấu trỳc cặp túc)

- Khụng cú hiện tượng bắt cặp giữa cỏc mồi trong cựng phản ứng PCR (hiện tượng primer – dimer) đặc biệt ở đầu 3’.

- Khoảng cỏch giữa hai mồi trờn trỡnh tự đớch < 400 bazơ - Nhiệt độ núng chảy giữa mồi xuụi và mồi ngược ≤ 5oC

- Kớch thước sản phẩm PCR nhõn bội cần phự hợp giữa 4 cặp mồi để khi điện di trờn bản gel polyacrylamide nhuộm bạc khụng cú sự chồng chộo giữa cỏc sản phẩm (thể hiện ở băng ADN trờn bản gel điện di). Khoảng kớch thước sản phẩm PCR yờu cầu cho 4 mồi thiết kế cần nằm trong khoảng từ 150 - 350 bp.

Trong luận ỏn này, căn cứ vào trỡnh tự tham khảo của cỏc locut nghiờn cứu, chỳng tụi dự kiến xỏc định khoảng kớch thước của sản phẩm PCR khi thiết kế mồi cho cỏc locut như sau:

- Locut HPRTB: khoảng 150 - 200bp

- Locut Amelogenin: khoảng 210 - 220bp

- Locut D8S1179: khoảng 230 - 270 bp

Để thực hiện được cỏc yờu cầu thiết kế nờu trờn, chỳng tụi sử dụng phần mềm thiết kế mồi Primer Premier 5. Cỏc bước chung của quy trỡnh thiết kế mồi bao gồm:

- Xỏc định trỡnh tự đoạn gen và vị trớ đoạn lặp - Trớch đoạn gen đưa vào phần mềm thiết kế mồi - Sàng lọc, lựa chọn mồi theo tiờu chớ phự hợp. Cụ thể được thực hiện với mỗi locut như sau:

- Locut HPRTB: Dựa trờn mó genbank M26434 của locut HPRTB [23, 25, 109], chỳng tụi xỏc định được trỡnh tự trỡnh tự nucleotit nằm trờn NST X tại vị trớ Xq26, cú độ dài 56737bp. Theo cỏc tài liệu đó cụng bố [23, 25, 109], trỡnh tự này cú chứa 13 đơn vị lặp của locut HPRTB, với cấu trỳc lặp là [TCTA]. Từ trỡnh tự và cấu trỳc đoạn lặp đó biết, chỳng tụi xỏc định vị trớ đoạn lặp của locut, sau đú tiến hành trớch xuất đoạn nucleotit cú chứa phần nhõn lặp đưa vào phần mềm thiết kế. Đoạn lặp của locut xỏc được từ vị trớ 22928 đến 22980. Đoạn nucleotit được trớch xuất cú chiều dài 780bp từ vị trớ 22561 đến vị trớ 23340 (phụ lục 1a). Căn cứ cỏc tiờu chớ đặt ra và dựa trờn kết quả bỏo cỏo của phần mềm thiết kế về thụng số cho mỗi cặp mồi, chỳng tụi tiến hành lựa chọn cỏc cặp mồi phự hợp cho locut HPRTB.

- Locut D8S1179: Mồi của locut D8S1179 cũng được xỏc định theo cỏc bước đó nờu, dựa trờn mó genbank AF216671 và cấu trỳc đoạn lặp được cụng bố [TCTA]1[TCTG]1[TCTA] 11 [23, 25, 109]. Đoạn nucleotit chỳng tụi trớch xuất để đưa vào phần mềm thiết kế cú vị trớ từ 2821 đến 3660, mang 13 đoạn lặp, vị trớ từ 3200 đến 3251 (phụ lục 1b).

- Locut F13A01: Mồi của locut F13A01 được xỏc định theo cỏc bước đó nờu, dựa trờn mó genbank M21986 và cấu trỳc đoạn lặp được cụng bố [AAAG]7 [23, 25, 109]. Đoạn nucleotit chỳng tụi trớch xuất để đưa vào phần mềm thiết kế cú vị trớ từ 1 đến 660, mang 7 đoạn lặp, vị trớ từ 248 đến 275 (phụ lục 1c).

- Locut Amelogenin: Trỡnh tự của locut Amelogenin được xỏc định căn cứ mó genbank M55418 và M55419 [23, 109]. Một số cặp mồi đó được thiết kế nhằm nhõn bội trỡnh tự ADN khụng tương đồng trờn nhiễm sắc thể X và Y, với mục đớch phõn biệt cỏ thể nam và nữ đồng thời phối với được với cỏc locut STR trong cựng một phản ứng [23, 25]. Ngoài ra, mồi thiết kế cần đảm bảo bắt cặp hoàn toàn, trỏnh rơi vào những vị trớ khụng tương ứng giữa NST X và Y. Căn cứ vào cỏc tiờu chớ đó đặt ra về kớch thước sản phẩm PCR và yờu cầu khi phối hợp mồi cho phản ứng multiplex PCR, chỳng tụi tham khảo cỏc trỡnh tự mồi đó cụng bố và lựa chọn cặp mồi phự hợp cho locut Amelogenin.

2.3.2. Tỏch chiết ADN

Mẫu mỏu lưu trờn thẻ bảo quản được lấy từ tủ lưu mẫu (-20oC) và tiến hành quỏ trỡnh tỏch chiết bằng phương phỏp tỏch vụ cơ cú sử dụng chelex [25], thực hiện theo cỏc bước sau:

Bước 1. Cắt nhỏ một phần giấy cú chứa mẫu trờn thẻ thu mẫu (khoảng

0,5 x 0,5 cm) cho vào tube 1,5ml. Thờm 1 ml PBS, lắc đều ủ ở nhiệt độ phũng trong 30 phỳt.

Bước 2. Ly tõm 14.000 vũng / phỳt trong 1 phỳt, thu lấy cặn. Tiếp tục

thờm 1ml PBS, vortex, ly tõm 14.000 vũng/phỳt, thu cặn (lặp lại 2 lần).

Bước 4. Thờm 150 l chelex 10%, vortex, đun sụi 10 phỳt.

Bước 5. Ly tõm dịch cú chứa mẫu và chelex 10.000 vũng/phỳt trong 10

phỳt, loại bỏ cặn thu dịch nổi sử dụng cho phản ứng PCR. 2.3.3. Phương phỏp PCR đa mồi (multiplex PCR)

2.3.3.1. Đối với cỏc locut F13A01, D8S1179, Amelogenin, HPRTB:

Trước khi thực hiện phản ứng PCR đa mồi, chỳng tụi thực hiện xỏc định điều kiện nhõn bội thớch hợp đối với từng locut đơn dựa trờn thành phần phản ứng và chu trỡnh nhiệt cơ sở của Buttler thực hiện đối với cỏc locut STR [23]. Sau đú dựa trờn điều kiện PCR đơn locut, chỳng tụi thực hiện thử

nghiệm và lựa chọn điều kiện PCR thớch hợp cho việc nhõn bội phức 4 locut. Theo Buttler, trong phản ứng PCR đa mồi, hai yếu tố quan trọng nhất là trỡnh tự và nồng độ mồi. Cỏc thành phần tiếp theo là nồng độ ion Mg và nồng độ dNTP, thụng thường hai thành phần này sẽ tăng gần như tương đối theo tỷ lệ mồi sử dụng so với thành phần đó xỏc định ở phản ứng PCR đơn locut. Trờn cơ sở đú, chỳng tụi xỏc định thực hiện thử nghiệm cỏc thành phần phản ứng như sau:

Bảng 2.1. Cỏc thụng số thử nghiệm thành phần PCR phức 4 locut F13A01, D8S1179, Amelogenin và HPTRB

Thành phần thử nghiệm Nồng độ thử nghiệm (*) Nồng độ sử dụng của cỏc thành phần khỏc trong phản ứng Mồi Thử nghiệm bắt đầu từ tỷ lệ nồng độ như nhau đối với mỗi locut sau đú điều chỉnh đến tỷ lệ tối ưu.

MgCl2 : 2mM; dNTP: 400M; Taq ADN polymerase 2U; ADN khuụn: 1ng (**);

MgCl2 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 (mM)

dNTP: 400M; Taq ADN polymerase 2U; ADN khuụn: 1ng; Mồi: theo tỷ lệ đó tối ưu.

dNTP 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 (M)

Taq ADN polymerase 2U; ADN

khuụn: 1ng; Mồi và MgCl2: theo tỷ lệ đó tối ưu.

Taq ADN

polymerase 0; 0,5; 1; 2; 3 (U)

ADN khuụn: 1ng; Mồi, MgCl2 và dNTP: theo tỷ lệ đó tối ưu.

ADN khuụn 0, 1, 2, 5, 10,15 (ng) Mồi, MgCl2, dNTP và Taq ADN polymerase theo tỷ lệ đó tối ưu.

(*): Chu trỡnh nhiệt sử dụng để thử nghiệm cỏc nồng độ: dựa trờn chu trỡnh nhiệt cơ sở của Buttler đối với cỏc locut STR đơn, nhiệt độ gắn mồi 60oC [23].

(**): Cỏc thành phần MgCl2, dNTP, Taq ADN polymerase và ADN khuụn được sử dụng gấp đụi nồng độ so với cỏc nồng độ xỏc định cho phản ứng PCR locut đơn dựa trờn thành phần phản ứng cơ sở của Buttler [23].

Nhiệt độ bắt cặp mồi được thử nghiệm trờn cơ sở tớnh toỏn lý thuyết (qua phần mềm thiết kế mồi) và trờn cơ sở kết quả xỏc định điều kiện phản ứng PCR cho cỏc locut đơn. Dải nhiệt độ gắn mồi được lựa chọn để tối ưu cho 4 locut trờn mỏy chu trỡnh nhiệt Gradient Icycler (BioRad) là cỏc nhiệt độ 55oC- 55,7oC - 56,7oC - 58,1 oC - 60,2 oC - 61,6oC - 62,6oC - 63oC.

2.3.3.2. Đối với cỏc locut cũn lại: phản ứng PCR được thực hiện sử

dụng cỏc bộ KIT nhõn bội ADN với mồi tự thiết kế và thang alen chỉ thị tự chế tạo dựa trờn cỏc nghiờn cứu trước đõy [2-5]. Chu trỡnh nhiệt đối với cỏc locut được thực hiện như sau:

- Locut D5S818, D7S820, D13S317 (thuộc bộ KIT 3D); locut D16S539, D3S1358, vWA (thuộc bộ KIT DDW) : 95oC - 3 phỳt; (94oC -1 phỳt; 58oC -1 phỳt; 72oC - 1,5 phỳt) x 35 chu kỳ; 72oC - 10 phỳt.

- Locut CSF1PO, TPOX và TH01: 95oC - 3 phỳt; (94oC -1 phỳt; 66oC - 1 phỳt; 72oC - 1,5 phỳt) x 35 chu kỳ; 72oC - 10 phỳt.

- Locut F13B, FES/FPS, LPL (thuộc bộ KIT FFL): 95oC - 3 phỳt; (94oC -1 phỳt; 60oC -1 phỳt; 72oC - 1,5 phỳt) x 35 chu kỳ; 72oC - 10 phỳt.

2.3.4. Phương phỏp điện di và phõn tớch sản phẩm PCR

2.3.4.1. Điện di trờn gel agarose [81]

Gel agarose 2% được chuẩn bị từ bột agarose và đệm TBE 1X. Sau khi đun sụi tan hoàn toàn, gel được để nguội (khoảng 50oC) và đổ vào khuụn gel

đó lắp lược để tạo giếng tra mẫu, chuẩn bị cho điện di. Cỏc bước điện di sản phẩm PCR:

Bước 1. Đặt gel trong bể điện di cú chứa dung dịch đệm TBE 1X. Bước 2. Trộn sản phẩm PCR với đệm mẫu và tra vào cỏc giếng của bản

gel.

Bước 3. Chạy điện di với điện thế sử dụng khoảng 100 V trong thời

gian 15 - 20 phỳt.

2.3.4.2. Điện di trờn gel polyacrylamide biến tớnh cú urờ

Phương phỏp điện di trờn gel polyacrylamide được dựng để phõn tỏch cỏc đoạn ADN cú kớch thước dưới 1000bp. Phương phỏp này thao tỏc phức tạp hơn so với phương phỏp điện di gel agarose nhưng kết quả phõn tỏch ADN tốt hơn do độ phõn giải cao của chỳng cao hơn [96].

* Chuẩn bị gel polyacrylamide biến tớnh cú urờ:

Chuẩn bị dung dịch gel polyacrylamide 5%, ure 7M gồm: Urea 17,5g; TBE 5X 5 ml; Acrylamide 2,85 g; Bis acrylamide 0,15 g; nước được bổ sung cho đủ 50ml. Khuấy đều cho tan hết cỏc thành phần. Thờm 60àl TEMED và 90àl APS 40%, khuấy đều.

Đổ gel vào khuụn kớnh đó chuẩn bị sẵn, để gel polymer húa trong 1h sau đú tiến hành điện di.

* Chuẩn bị mẫu và thang alen:

Sản phẩm PCR và thang alen được trộn với đệm mẫu trước khi điện di theo tỷ lệ 3l sản phẩm PCR/ thang alen : 3l đệm mẫu sau đú vortex và ly tõm nhẹ.

Mẫu và thang alen được ủ ở 95oC trong 5 phỳt rồi làm lạnh ngay sau đú bằng cỏch cho cỏc ống chứa mẫu và thang alen lờn khay đỏ vụn.

* Điều kiện điện di:

Chuẩn bị đệm điện di TBE 0,5X đổ vào cỏc bể điện di. Trước khi tra mẫu, gel được chạy khụng tải với điện ỏp 60 W trong thời gian 30 phỳt để nhiệt độ bản gel đạt 50o C. Khi bản gel đó đạt được nhiệt độ cần thiết, tiến hành tra mẫu, thang alen vào từng giếng và chạy điện di với điện ỏp 60W trong thời gian 90 - 105 phỳt. Mẫu và thang alen đó được chuẩn bị được tra lần lượt vào cỏc giếng điện di (2l/giếng đối với mẫu và 4l/giếng đối với thang alen).

2.3.4.3. Phỏt hiện băng ADN sau điện di * Phương phỏp nhuộm bằng ethidium bromide

Ethidium bromide thường được sử dụng để phỏt hiện cỏc băng ADN trờn gel agarose. Độ nhạy của phương phỏp phỏt hiện này khoảng 1ng/băng ADN [81, 96]. Dung dịch ethidium bromide được chuẩn bị với nồng độ 0,5g/ml. Bản gel agarose sau khi điện di được ngõm trong bể chứa dung dịch ethidium trong 5 -10 phỳt, sau đú được rửa qua bằng nước cất rồi đưa lờn đốn soi UV để kiểm tra sự cú mặt của cỏc băng ADN (sản phẩm PCR).

* Phương phỏp nhuộm bạc: Bao gồm cỏc bước thực hiện như sau [25]:

Bước 1. Cố định bản gel bằng axit axetic 10% (30 phỳt) Bước 2. Rửa bản gel bằng nước cất 2 lần (30 phỳt).

Bước 3. Nhuộm bản gel bằng dung dịch nhuộm (0,1% nitrat bạc; 3,7% formaldehyde) – 30 phỳt.

Bước 4. Rửa bản gel bằng nước cất 3 - 5 giõy.

Formaldehyde 3,7%; Na2S2O3 0,2%)

Bước 6. Cố định lại bằng axit axetic 10% (5 phỳt) Bước 7. Rửa sau cựng bằng nước cất (5 phỳt) 2.3.5. Phương phỏp chế tạo thang alen

Phương phỏp tạo thang alen được thực hiện dựa trờn sự kết hợp cỏc alen khỏc nhau của cỏc cỏ thể khảo sỏt được trong quần thể nghiờn cứu (hỡnh 2.1). Vớ dụ, để tạo ra một thang alen bao gồm cỏc alen 6, 7, 8, 9 và 10, chỳng ta cú thể chọn mẫu của cỏc cỏ thể trong quần thể với kiểu gen là: 6 - 8; 7 - 10 và 9 - 9 kết hợp với nhau.

Hỡnh 2.1. Hỡnh minh họa sự phối hợp cỏc alen khỏc nhau trong phương phỏp chế tạo thang alen

(LD: Thang alen; M1 - M3: cỏc mẫu từ cỏc cỏ thể

khỏc nhau mang cỏc alen khỏc nhau dựng để phối hợp tạo thang alen.)