12 M50 34 M50 ĐC (-)
3.3.CHẾ TẠO THANG ALEN 4 LOCUT F13A01, D8S1179, AMELOGENIN, HPRTB
AMELOGENIN, HPRTB
Trờn cơ sở kết quả kết quả khảo sỏt alen chỳng tụi đó tập hợp và chế tạo được thang alen cho 04 locut F13A01, D8S1179, Amelogenin và HPRTB.
3.3.1. Kết quả chế tạo thang alen locut F13A01
3.3.1.1. Kết quả lựa chọn và xỏc định alen cho locut F13A01
Đối với locut F13A01, chỳng tụi đó lựa chọn được 06 alen khỏc nhau. Căn cứ vào mẫu K562 cú kiểu gen dị hợp tử 4 - 5, chỳng tụi đó xỏc định được kớch thước và số đoạn lặp của 06 alen thu được như sau (Bảng 3.6)
Bảng 3.6. Kết quả lựa chọn và xỏc định alen cho locut F3A01
Alen (Số đoạn lặp) 3.2 4 5 6 7 8 Kích thước (bp) 279 283 287 291 295 299
3.3.1.2. Kết quả giải trỡnh tự một số alen locut F13A01
Để khẳng định thờm kết quả xỏc định alen, ngoài việc so sỏnh cỏc alen với kiểu gen của mẫu chuẩn K562, chỳng tụi đồng thời chọn một số alen của locut F13A01 để giải trỡnh tự. Cỏc alen được giải trỡnh tự là alen 3,2; alen số 4
a. Kết quả giải trỡnh tự alen số 3,2 (Trỡnh tự đoạn lặp thu được TTTTT(CTTT)4 )
c. Kết quả giải trỡnh tự alen số 8 (Trỡnh tự đoạn lặp thu được (CTTT)8
Kết quả giải trỡnh tự được thể hiện ở hỡnh 3.24. Cỏc trỡnh tự xỏc định được như sau:
- Alen 3,2 cú trỡnh tự là TTTTT(CTTT)4
- Alen 4 cú trỡnh tự là TTTTACT(CTTT)4
- Alen 8 cú trỡnh tự là (CTTT)8
b. Kết quả giải trỡnh tự alen số 4
(Trỡnh tự đoạn lặp thu được TTTTACT(CTTT)4
ttttactctttctttctttcttt
ctttctttctttctttctttctttctttcttt
Kết quả xỏc định trỡnh tự của chỳng tụi phự hợp với cỏc tài liệu đó cụng bố [23] và phự hợp với kết quả xỏc định alen cho locut F13A01 đó nờu trờn. Khỏc với một số locut STR cú cấu trỳc lặp lại đơn giản cú cỏc đơn vị lặp giống nhau về chiều dài và trỡnh tự, locut F13A01 cú cấu trỳc dạng phức tạp (complex repeats), bao gồm cỏc trỡnh tự lặp và khụng lặp lại xen kẽ.
Locut này cũn cú điểm đặc biệt là cú alen lẻ 3,2. Đặc điểm alen này là cú chiều dài chỉ cỏch alen liền kề (alen số 4) khoảng cỏch 2bp, trong khi cỏc alen cũn lại (alen 4 đến 8) cỏch đều nhau một khoảng cỏch 4bp. Tuy nhiờn, vẫn cú thể xỏc định được alen 3,2 trờn bản gel polyacrylamide biến tớnh.
3.3.1.3. Kết quả chế tạo thang alen đa thế hệ bằng kỹ thuật PCR đa cấp
6 alen đó lựa chọn từ locut F13A01 sau khi tinh sạch được kết hợp để tạo thành bộ thang alen. Để làm giàu thang alen phục vụ cho việc khảo sỏt tần suất alen cho locut F13A01, chỳng tụi đó thực hiện PCR nhõn bội đồng thời 6 alen khỏc nhau trong bộ thang alen bằng phương phỏp PCR nhiều cấp.
Kết quả nhõn bội (hỡnh 3.25) cho thấy thang alen cỏc thế hệ (nhõn bội ở cỏc nồng độ pha loóng khỏc nhau) đều cú chất lượng như nhau, thể hiện ở cỏc băng phõn tỏch rừ trờn bản gel điện di. Bộ thang bao gồm 6 alen, được ký hiệu theo quy ước quốc tế là 3.2; 4; 5; 6; 7 và 8 căn cứ vào cấu trỳc đơn vị lặp lại. So với alen cú trong bộ kit FFV của hóng Promega [73] bộ thang alen của chỳng tụi cú thờm alen 3.2. Tuy nhiờn, bộ thang alen của chỳng tụi chưa cú cỏc alen cú kớch thước lớn như của Promega, đú là cỏc alen số 10; 11; 12; 13; 14; 15; 16.
Hỡnh 3.25. Kết quả chế tạo thang alen cho locut F13A01
Bộ thang alen locut F13A01 bao gồm cỏc alen số 3.2; 4; 5; 6; 7 và 8.
M20: marker 20bp; 1: Thang alen thế hệ I, sử dụng ADN khuụn là hỗn hợp cỏc alen đó tinh sạch; 2, 3, 4: Thang alen thế hệ II, sử dụng ADN khuụn từ thang alen thế hệ I pha loóng ở cỏc nồng độ 1/1.000 (2), 1/5.000 (3) và 1/10.000 (4); 5, 6, 7: Thang alen thế hệ III, sử dụng ADN khuụn là thang alen thế
hệ II (tạo thành từ sản phẩm pha loóng 1/10.000) tiếp tục pha loóng ở cỏc nồng độ 1/1.000 (5), 1/5.000 (6) và 1/10.000 (7); ĐC (-): mẫu đối chứng õm PCR; K562: mẫu ADN chuẩn.
3.3.2. Kết quả chế tạo thang alen locut D8S1179
3.3.2.1. Kết quả lựa chọn và xỏc định alen cho locut D8S1179
Khỏc với locut F13A01 cú 6 alen, locut D8S1179 cú số lượng alen lựa chọn được nhiều hơn. Trong số cỏc mẫu khảo sỏt, chỳng tụi đó lựa chọn được 10 alen : đú là alen số 8; 10; 11; 12; 13; 14; 15; 16; 17; 18. Riờng alen số 9 được lựa chọn từ mẫu nguồn khỏc cũng được chỳng tụi đưa vào để xõy dựng thang alen. Căn cứ vào mẫu K562 cú kiểu gen đồng hợp tử 12 - 12, chỳng tụi đó xỏc định được kớch thước và số đoạn lặp của cỏc alen (bảng 3.7).
Bảng 3.7. Kết quả lựa chọn và xỏc định alen cho locut D8S1179
Alen
(Số đoạn lặp) 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Kớch thước
(bp) 223 227 231 235 239 243 247 251 255 259 263
3.3.2.2. Kết quả giải trỡnh tự một số alen locut D8S1179
Cũng như đối với locut F13A01, chỳng tụi cũng tiến hành lựa chọn một số alen của locut D8S1179 giải trỡnh tự nhằm xỏc định chớnh xỏc số đoạn lặp của cỏc alen thu được. Cỏc alen được giải trỡnh tự là alen số 9 và alen số 13.
300bp 280bp M20 1 ĐC 2 3 4 ĐC 5 6 7 ĐC K562 (-) (-) (-) 8 7 6 5 4 3.2 8 7 6 5 4 3.2 8 7 6 5 4 3.2
Kết quả giải trỡnh tự được thể hiện ở hỡnh 3.26. Cỏc trỡnh tự xỏc định được như sau:
- Alen số 9 cú trỡnh tự là (TATC)9
- Alen 13 cú trỡnh tự là [TCTA]1[TCTG]1[TCTA]11
Kết quả xỏc định trỡnh tự của chỳng tụi phự hợp với cỏc tài liệu đó cụng bố [23, 73] và phự hợp với kết quả xỏc định alen cho locut D81179 đó nờu trờn.
Khỏc với locut F13A01, cỏc alen của locut D8S1179 mà chỳng tụi khảo sỏt được cú cấu trỳc lặp lại đơn giản. Vỡ vậy, việc đọc và xỏc định 11 alen của locut D8S1179 bằng kỹ thuật điện di nhuộm bạc cũng khỏ dễ dàng.
a. Kết quả giải trỡnh tự alen số 9
(trỡnh tự đoạn lặp thu được (TCTA)9 )
b. Kết quả giải trỡnh tự alen số 13
(trình tự đoạn lặp thu được [TCTA]1[TCTG]1[TCTA]11) tctatctatctatctatctatctatctatctatcta
tctatctgtctatctatctatctatctatctatctatctatctatctatcta
3.3.2.3. Kết quả chế tạo thang alen đa thế hệ bằng kỹ thuật PCR đa cấp:
Cỏc alen đó lựa chọn của locut D8S1179 sau khi tinh sạch được kết hợp để tạo thành bộ thang alen cho locut D8S1179. Để làm giàu thang alen phục vụ cho việc khảo sỏt tần suất alen cho locut D8S1179, chỳng tụi đó thực hiện PCR nhõn bội đồng thời 11 alen khỏc nhau trong bộ thang alen bằng phương phỏp PCR nhiều cấp.
Kết quả nhõn bội (hỡnh 3.27) cho thấy: Thang alen cỏc thế hệ (nhõn bội ở cỏc nồng độ pha loóng khỏc nhau) đều cú chất lượng như nhau, thể hiện ở cỏc băng phõn tỏch rừ trờn bản gel điện di. Bộ thang bao gồm 11 alen, được ký hiệu theo quy ước quốc tế là alen số 8; 9; 10; 11; 12; 13; 14; 15; 16; 17 và 18 căn cứ vào cấu trỳc đơn vị lặp của locut. Những alen này cũng là những alen cú trong cỏc bộ kit Power Plex Fusion của hóng Promega [73] và bộ kit AmpFlSTR Identifiler Plus của Thermo Fisher Scientific [17]. Riờng alen số 19 đó cú trong cỏc bộ kit của Promega và Thermo nhưng chưa cú trong nghiờn cứu của chỳng tụi.
Hình 3.27. Kết quả chế tạo thang alen cho locut D8S1179
Bộ thang alen locut D8S1179 bao gồm các alen số 8; 9; 10; 11; 12; 13; 14; 15; 16; 17 và 18.
M20: marker 20bp; 1: Thang alen thế hệ I, sử dụng ADN khuụn là hỗn hợp cỏc alen đó tinh sạch; 2, 3, 4: Thang alen thế hệ II, sử dụng ADN khuụn từ thang alen thế hệ I pha loóng ở cỏc nồng độ 1/1.000 (2), 1/5.000 (3) và 1/10.000 (4); 5, 6, 7: Thang alen thế hệ III, sử dụng ADN khuụn là thang alen thế
hệ II (tạo thành từ sản phẩm pha loóng 1/10.000) tiếp tục pha loóng ở cỏc nồng độ 1/1.000 (5), 1/5.000 (6) và 1/10.000 (7); ĐC (-): mẫu đối chứng õm PCR; K562: mẫu ADN chuẩn.
M20 1 ĐC 2 3 4 ĐC 5 6 7 ĐC K562 (-) (-) (-) (-) (-) (-) 260bp 240bp 18 17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 18 17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 18 17 16 15 14 13 12 11 10 9 8