Các aurone đã được tổng hợp theo phương pháp phổ biến nhất là ngưng tụ
giữa các benzofuranone với các benzaldehyde. Chất trung gian chìa khĩa 3,4- dihydroxybenzofuranone (5b) khơng sẵn cĩ trên thương mại đã được nghiên cứu
tổng hợp theo 2 phương pháp từ phloroglucinol một hợp chất sẵn cĩ trong thương mại. Các aurone cũng được nghiên cứu tổng hợp theo các phương pháp khác nhau
để thu được các hydroxyaurone (chất 56, chất 76); các methoxyaurone (chất 55,
chất 77); các aurone với nhĩm thế methoxy ở vịng A và nhĩm thế hydroxyl ở vịng B (chất 80, chất 81); các aurone với nhĩm thế hydroxy ở vịng A và nhĩm thế
methoxy ở vịng B (chất 78, chất 79) (Hình 43). Sơ đồ phản ứng:
Hình 43 : Sơ đồ tổng hợp các aurone cĩ các nhĩm thế khác nhau.
a. ClCH2CN, Et2O, ZnCl2, HCl 0°C, 24 h; b. 1) HCl, hồi lưu; 2) MeONa/MeOH, hồi lưu (Hiệu suất a, b: 46%); c. H2O, hồi lưu (Hiệu suất a, c: 41%); d. MeI/K2CO3 (69,5% - 77%); e. 3,4-dihydrobenzaldehyde hoặc 4-hydroxybenzaldehyde, HCl/MeOH (52-
65%);g. 3,4-dimethoxybenzaldehyde hoặc 4-methoxybenzaldehyde, HCl/MeOH hoặc NaOH/MeOH, (74 %-72%) ;h. 3,4-dimethoxybenzaldehyde hoặc 4-methoxybenzaldehyde, HCl/MeOH hoặc NaOH/MeOH, (89% - 93%); m. 3,4-dihydrobenzaldehyde hoặc 4- hydroxybenzaldehyde, HCl/MeOH (64%-77%).
3.1.1. Tổng hợp chất trung gian chìa khĩa 4,6-dihyroxybenzofuran-3(2H)-one (5b)
Chất trung gian chìa khĩa benzofuranone 5b đã được nghiên cứu tổng hợp theo 2 phương pháp:
Phương pháp 1
Trong bình cầu 3 cổ được lắp sinh hàn, bơm hút chân khơng và nạp đầy khí N2 cho hỗn hợp của phloroglucinol (25,2 g; 0,2 mol) trong diethyl ether khan (500 mL) được làm lạnh đến 00C. Hỗn hợp chloroacetonitrile (15,1 g; 0,2 mol) và ZnCl2 (2,7 g; 0,02 mol) được nạp thêm vào bình phản ứng. Sục khí HCl vào hỗn hợp phản
ứng trong 2 h ở 00C. Hỗn hợp phản ứng được tiếp tục khuấy qua đêm. Sau đĩ lọc,
rửa kết tủa với diethyl ether và sấy khơ trong chân khơng, thu được chất rắn (3). Hợp chất 3 được hịa tan trong nước nĩng (500 mL) và đun hồi lưu trong 7 h. Sau đĩ, hỗn hợp này được làm lạnh xuống nhiệt độ phịng. Các kết tủa trắng được thu
thập bằng cách lọc, rửa sạch bằng nước và sấy khơ trong chân khơng thu được 5b (21,2 g, 65%).
Phương pháp 2
Trong bình cầu 3 cổ được lắp sinh hàn, bơm hút chân khơng và nạp đầy khí N2 cho hỗn hợp của phloroglucinol (25,2 g; 0,2 mol) trong diethyl ether khan (500 mL ) được làm lạnh đến 00C. Hỗn hợp chloroacetonitrile (15,1 g; 0,2 mol) và ZnCl2 (2,7 g; 0,02 mol) được nạp thêm vào bình phản ứng. Sục khí HCl vào hỗn hợp phản
ứng trong 2 h ở 00C. Hỗn hợp phản ứng được tiếp tục khuấy qua đêm. Sau đĩ lọc,
rửa kết tủa với diethyl ether và sấy khơ trong chân khơng, thu được 30,6 g muối iminium (3). Muối iminium 3 được hịa tan trong dung dịch HCl 1N (643 mL),
khuấy ở nhiệt độ phịng trong 3 h (xuất hiện kết tủa trắng) và sau đĩ đun hồi lưu
trong 2 h. Hỗn hợp này được làm lạnh xuống 6oC qua đêm. Các kết tủa thu được bằng cách lọc, rửa sạch với nước lạnh, sấy khơ trong chân khơng và hịa tan trong dung dịch MeONa/MeOH 1,8 M (195 mL). Dung dịch thu được được đun hồi lưu trong 2 h, sau đĩ làm lạnh xuống nhiệt độ phịng và trung hịa với dung dịch HCl
1N (22 mL). Cất loại methanol, phần cịn lại được chiết với ethyl acetate (40 mL). Dịch chiết được rửa lại bằng nước và làm khan bằng Na2SO4. Cất loại dung mơi thu
Chất 3 T0n/c: 239-232 oC 1H-NMR (DMSO-d6): δ (ppm) 12,60 , 11,02 , 9,86 (3H, br s, 2 × s, 3 × OH), 6,33 , 6,08 (2H, 2 × d, J = 1,5 Hz, H-3, H-5), 5,44 (2H, s, CH2). 13C-NMR (DMSO-d6): δ (ppm) 175,9, 173,6, 173,0, 160,6 (Ph C-2, C-4, C-6, C=NH2+), 99,41 (Ph C-1), 97,13 , 90,14, (Ph C-3, C-5), 75,35 (CH2). Chất 5b T0n/c: 252-254oC; 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 10,54 (2H, br s, OH), 5,91(2H, s, H-5, H-7), 4,55 (2H, s, C-2). 13C-NMR(125 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 194,0 (C=O), 175,6 , 167,6 , 157,5 (C-4, C-6, C-8), 102,7 , 96,2 , 90,1(C-5, C-7, C-9), 74,8 (C-2). Tổng hợp 4,6-dimethoxybenzofuran-3(2H)-one (18)
Trong bình cầu 3 cổ được lắp sinh hàn, bơm hút chân khơng và nạp đầy khí N2 cho hỗn hợp 4,6-dihydroxybenzofuran-3(2H)-one (5b, 10 mmol) trong DMF (30 mL) và K2CO3 (20 mmol), cho tiếp từ từ methyl iodide (30 mmol) vào hỗn hợp và
được đun ở 80oC trong 1 giờ. Nước đá đã được thêm vào hỗn hợp phản ứng. Dung dịch được chiết với EtOAc. Dịch chiết EtOAc được làm khan bởi Na2SO4 sau đĩ cất dưới áp suất giảm loại dung mơi. Cặn chiết được kết tinh trong hỗn hợp của n-
hexane / EtOAc thu được dimethoxybenzofuranone 18 với hiệu suất 77%, sản phẩm là một chất rắn màu trắng, T0n/c: 132-134oC.
1H-NMR (DMSO-d6): δ (ppm) 6,35 và 6,16 (2H, 2 × d, J = 1,8 Hz, H-5 và H-7), 4,64 (2H, s, H-2), 3,85 (3H, s, OCH3), 3,82 (3H, s, OCH3).
13C-NMR (DMSO-d6): δ (ppm) 193,9 (C=O), 176,2 , 169,1 , 158,2 (C-8, C-6, C-4), 104,0 (C-9), 92,8 , 89,3 (C-5, C- 7), 75,2 (C-2), 55,8 và 56,2 (2 × OCH3). 3.1.2. Tổng hợp các hydroxyaurone (Z)-2-[(3,4-dihydroxyphenyl)methylene]- 4,6-dihydroxybenzofuran-3(2H)-one (56) và (Z)-2-[(4- hydroxyphenyl)methylene]-4,6-dihydroxybenzofuran-3(2H)-one (76)
Các hydroxyaurone đã được nghiên cứu tổng hợp bằng phản ứng ngưng tụ trực tiếp giữa các hydroxybenzofuranone với các hydroxybenzaldehyde sử dụng xúc tác HCl/MeOH ở nhiệt độ phịng .
Tổng hợp (Z)-2-[(3,4-dihydroxyphenyl)methylene]-4,6- dihydroxybenzofuran-3(2H)-one (56)
Trong bình cầu 3 cổ 50 mL đã nạp đầy khí nitơ cho hỗn hợp 4,6-
dihydroxybenzofuran-3(2H)-one (5b, 1,0 mmol) và 3,4-dihydroxybenzaldehyde (1,0 mmol) trong methanol (14 mL), HCl 36,0% (2,4 eq) được thêm vào ở nhiệt độ phịng. Hỗn hợp phản ứng được khuấy ở nhiệt độ phịng trong 24 h cho đến khi
phản ứng kết thúc (kiểm tra bằng SKLM). Sau đĩ cất loại bỏ methanol, phần cịn lại
được chiết với EtOAc (3 × 10 mL). Dịch chiết được rửa sạch bằng 10% dung dịch
NaCl và làm khan bằng Na2SO4. Cất loại dung mơi dưới áp suất giảm, thu được sản phẩm thơ. Tinh chế sản phẩm bằng cách chạy qua cột trên silica gel, hệ dung mơi rửa giải n-hexane / EtOAc (1/1) thu được chất 56 với hiệu suất 52%.
Hợp chất 56 là một chất rắn màu vàng. T0n/c: 282-283°C
FT-IR: νKBr (cm-1): 3469, 3357, 3120, 3039, 2896, 2852, 1654, 1562, 1527, 1449, 1340, 1293, 1245, 1155, 1063, 846, 805, 675, 548, 505, 460.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 10,81, 9,53, 9,19 (4H, 3 × brs, 4 × OH); 7,38 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2′), 7,17 (1H, dd, J = 2,0, 8,5 Hz, H-6′), 6,81 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5′), 6,44 (1H, s, H-10), 6,17 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-7), 6,06 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-5). 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 179,0 (C=O), 167,5 (C-8), 166,9 (C-6), 158,1 (C-4), 147,4 (C-4’), 145,9 (C-2), 145,4 (C-3’), 123,9 (C-6’), 123,6 (C-1’), 117,6 (C-2’), 115,9 (C-5’), 109,6 (C-10), 102,9 (C-9), 97,6 (C-5), 90,3(C-7). Tổng hợp (Z)-2-[(4-hydroxyphenyl)methylene]-4,6-dihydroxybenzofuran- 3(2H)-one (76)
Tiến hành tương tự phản ứng ngưng tụ trực tiếp giữa (5b, 1,0 mmol) với 4- dihydroxybenzaldehyde (1,0 mmol) thu được chất 76 với hiệu suất 65 %.
Chất 76 là một chất rắn màu vàng. T0n/c: 292-294°C FT-IR: νKBr (cm-1): 3349, 2922, 1682, 1610, 1462, 1358, 1251, 1154, 1071, 819, 704, 618, 565. ESI-MS (negative): m/z = 269 [M-H]-. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 7,74 (2H, d, J = 8,7 Hz, H-2′, H-6′), 6,85 (2H, d, J = 8,7 Hz, H-3′, H-5′), 6,54 (1H, s, H-10), 6,20 (1H, d, J = 1,2 Hz, H-5), 6,06 (1H, d, J = 1,2 Hz, H-7). 13C -NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 179,2 (C=O), 167,6 , 167,2 , 158,8 , 158,3 (C-8, C-6, C-4, C-4’), 146,1 (C-2), 132,8 ( C-2’, C-6’), 123,4 (C-1’), 116,0 (C-3’, C-5’), 109,2 (C-10), 102,9 , 97,7 , 90,5 (C-5, 7, 9).
3.1.3. Tổng hợp các methoxyaurone (Z)-2-[(3,4-dimethoxyphenyl)methylene]- 4,6-dimethoxy-benzofuran-3(2H)-one (55) và (Z)-2-[(4-
methoxyphenyl)methylene]-4,6-dimethoxybenzofuran-3(2H)-one (77)
Các methoxyaurone cĩ các nhĩm thế hydroxyl đã được methyl hĩa (chất 55, chất 77) được ngưng tụ từ các methoxybenzofuranoen với các
methoxybenzaldehyde cĩ thể được tiến hành theo 2 phương pháp sử dụng xúc tác acid hoặc xúc tác base.
Phương pháp 1: Ngưng tụ trong mơi trường kiềm
Trong bình cầu 3 cổ 50 mL, hỗn hợp dung dịch của 4,6- dimethoxybenzofuran-3(2H)-one (18, 10 mmol) và 3,4-dimethoxybenzandehyde (10 mmol) trong MeOH (10 mL), được cho thêm dung dịch của KOH/MeOH (7,5 mg/15 mL). Hỗn hợp phản ứng được khuấy ở 60oC trong 30 phút, sau đĩ giảm xuống nhiệt độ phịng và trung hịa bằng HCl 10% cho đến pH = 3. Kết tủa màu
vàng hình thành được lọc, rửa bằng hỗn hợp MeOH / H2O (1/1) và kết tinh trong MeOH / H2O (10/1) thu được tinh thể hình kim màu vàng 55 (89%).
Phương pháp 2: ngưng tụ trong mơi trường acid
Trong bình cầu 3 cổ 50 mL đã nạp đầy khí nitơ cho 4,6-
dimethoxybenzofuran-3(2H)-one 18 (10 mmol) trong methanol (140 mL), 3,4-
dimetoxylbenzandehyde (10 mmol) và HCl (24 mmol). Hỗn hợp phản ứng được
khuấy ở nhiệt độ phịng 24 h cho đến khi phản ứng kết thúc (kiểm tra bằng SKLM). Sau đĩ cất loại bỏ methanol, phần cịn lại đã được chiết với EtOAc (3 × 10 mL).
Dịch chiết được rửa sạch bằng 10% dung dịch NaCl và làm khan bằng Na2SO4. Cất loại dung mơi dưới áp suất giảm, thu được sản phẩm thơ. Tinh chế sản phẩm bằng cách chạy qua cột ngắn trên silica gel, hệ dung mơi rửa giải n-hexane / EtOAc (1/1) thu được chất rắn màu vàng (91%)
FT-IR: νKBr (cm-1): 3010, 2946, 2840, 1690, 1603, 1514, 1421, 1250, 1099, 813, 469. ESI-MS: m/z = 343 [M + H]+. 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 7,54 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-2'), 7,51 (1H, dd, J = 8,5, 1,5 Hz, H-6 '), 7,05 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5'), 6,68 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-5), 6,67 (1H, s, H-10), 6,31 (1H, d, J = 1,5 Hz, H- 7), 3,90, 3,88, 3,83 và 3,82 (12H, s, 4 × OCH3), . 13C-NMR (125 MH, DMSO-d6): δ (ppm) 178,8 (C=O), 168,7, 168,0 , 158,8,(C-8, C-6, C-4), 150,2 , 148,7, 146,1(C-2, C-3 ', C-4' ), 124,9 (C-1'), 124,8 (C-6 '), 114,0 , 111,9, 110,2 (C-10, C-2 ', C-5'),104,2 (C-9), 94,3 , 89,8 (C-5, C-7), 56,5 , 56,1 và 55,6 (4 × OCH3).
Tiến hành tương tự phản ứng ngưng tụ chất 18 với 4-methoxylbenzaldehyde thu được aurone 77 ngưng tụ trong mơi trường kiềm với hiệu suất 90% và ngưng tụ trong mơi trường acid với hiệu suất 93% .
Chất 77 là chất lỏng dạng dầu màu vàng. FT-IR: νKBr (cm-1): 2933, 2833, 1690, 1604, 1500, 1453, 1343, 1251, 1083, 1012, 822, 641, 550, 431. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) 7,80 (2H, d, J = 9,0 Hz, H-2’, H-6’), 6,93 (2H, d, J = 9,0 Hz, H-3’, H-5’), 6,72(1H, s, H-10), 6,34 và 6,08 (2H, 2 × d, J = 1,7 Hz, H-5 và H-7), 3,93, 3,88, 3,84 (9H, 3 × s, 3 × OCH3). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ (ppm) 180,5 (C=O), 168,7, 168,6 (C-8, 6), 160,5 , 159,3 (C-4, 4’), 146,7 (C-2), 132,8 (C-2’, 6’), 125,3 (C-1'), 114,3 (C-3’, 5’), 110,9 (C-10), 105,4 (C-9), 93,9 , 89,1 (C -5, C-7), 56,1 , 56,0 và 55,2 (3 × OCH3).
3.1.4. Tổng hợp các aurone cĩ nhĩm thế OMe ở vịng A và nhĩm thế hydroxyl
Tổng hợp Z-2-[(3,4-dihydroxyphenyl)methyl]-4,6-dimethoxy-3(2H)- benzofuranone (80)
Hệ phản ứng gồm bình cầu 50 ml, được lắp sinh hàn, con khuấy từ, được hút chân khơng và nạp đầy N2. Hợp chất 18 ( 196 mg, 1 mmol) được hịa tan trong MeOH( 30ml). Hợp chất 3,4 dihydroxybenzandehyde ( 138 mg, 1mmol) được bổ sung thêm vào hỗn hợp phản ứng. Nhỏ từ từ hỗn hợp HCl/ MeOH ( 0.1 ml/ 5 ml) vào phản ứng, hỗn hợp phản ứng được khuấy ở nhiệt độ phịng trong 12 giờ, sau khi phản ứng kết thúc thấy xuất hiện tinh thể màu vàng. Lọc, rửa tinh thể bằng MeOH, phần dịch lọc được cất loại dung mơi dưới áp suất giảm,được chiết với EtOAc và
được chạy qua cột silica gel pha thường, hệ dung mơi rửa giải n-hexan/ EtOAc ( 3/1
v/v) thu được 201,6 g chất 80 chất rắn màu vàng với hiệu suất 64%. Chất 80 là tinh thể màu vàng FT-IR (KBr) νmax cm-1: 3420, 2941, 1671, 1595, 1524, 1434, 1347, 1262, 1214, 1104, 904, 817, 690, 523, 456. 1H-NMR(500 MHz, DMSO-d6): δ ( ppm) 3,87, 3,91 (6H, 2 × s, 2 × CH3), 6,32 (1H, d, J = 1,7 Hz, H-5), 6,54 (1H, s, CH), 6,61 (1H, d, J = 1,7 Hz, H-7), 6,81 (1H, d, J = 8,4 Hz, H-5’), 7,2(1H, dd, J = 8,4, 1,8 Hz, H-6’), 7,4 (1H, d, J = 1,8 Hz, H-2’), 9,17, 9,64 ( br s, 2 H, 2 × OH) 13C-NMR ( DMSO-d6): δ (ppm) 49,1, 56,7 (2 ×CH3), 90,2, 94,8 (C -5, C-7), 104,9 (C-3a), 111,5, 116,5, 118,5 (CH, C-2’, C-5’), 124,0 (C-6’), 124,8 (C-1’), 146,0, 146,1, 148,4( C-2, C-3’, C-4’), 159,4, 168,4, 169,1 (C-4, C-6, C-7a), 179,4(CO). Tổng hợp Z-2-[(4-hydroxyphenyl)methyl]-4,6-dimethoxy-3(2H)- benzofuranone (81).
Tiến hành tương tự phản ứng ngưng tụ chất 18 với 4-hydroxylbenzaldehyde thu
được aurone 81 với hiệu suất 77%.
Hợp chất 81 dạng tinh thể màu vàng chanh.
FT-IR (KBr) νmax cm-1: 3305, 3015, 1682, 1616, 1583, 1517, 1443, 1264, 1215, 1152, 1099, 811, 676, 558, 481. 1H-NMR(500 MHz, DMSO-d6): δ ( ppm) 3,87, 3,90 (6H, 2 × s, 2 × CH3), 6,31(1H, d, J = 1,7 Hz, H-5), 6,63 (1H, s, CH), 6,66 (1H, d, J = 1,7 Hz, H-7), 6,86 (1H, d, J = 8,4 Hz, H-5’), 7,2 (1H, dd, J = 8,4, 1,8 Hz, H-6’), 7,7 (1H, d, J = 1,8 Hz, H-2’), 10,1 ( br s, 1H, 1× OH) 13C-NMR ( DMSO-d6): δ (ppm) 56,07, 56,43 (2× CH3), 89,7, 94,2 (C -5, C-7), 104,2 (C-3a), 110,4, 115,9, 123,08 (CH, C-2’, C-5’), 133,02 (C-6’), 124,8 (C-1’), 145,64, 158,76( C-2, C-3’, C-4’), 159,09, 167,91, 168,56 (C-4, C-6, C-7a), 178,87(CO).
3.1.5. Tổng hợp các aurone cĩ nhĩm thế hydroxyl ở vịng A và nhĩm thế OMe
ở vịng B (chất 78, chất 79).
Tổng hợp Z-2-[(3,4-dimethoxyphenyl)methyl]-4,6-dihydroxy-3(2H)- benzofuranone (78).
Trong bình cầu 3 cổ 50 mL đã nạp đầy khí nitơ cho hỗn hợp 4,6-
dihydroxybenzofuran-3(2H)-one (5b, 1,0 mmol) và 3,4-dimethoxylbenzaldehyde (1,0 mmol) trong methanol (14 mL), HCl 36,0% (2,4 eq) được thêm vào ở nhiệt độ phịng. Hỗn hợp phản ứng được khuấy ở nhiệt độ phịng trong 24 h cho đến khi
phản ứng kết thúc (kiểm tra bằng SKLM). Sau đĩ cất loại bỏ methanol, phần cịn lại
được chiết với EtOAc (3 × 10 mL). Dịch chiết được rửa sạch bằng 10% dung dịch
NaCl và làm khan bằng Na2SO4. Cất loại dung mơi dưới áp suất giảm, thu được sản phẩm thơ. Tinh chế sản phẩm bằng cách chạy qua cột trên silica gel, hệ dung mơi rửa giải n-hexane / EtOAc (1/1) thu được chất 78 với hiệu suất 74% .
Hợp chất 78 là một chất rắn màu vàng. 1H-NMR(500 MHz, DMSO-d6): δ ( ppm) 3,11, 3,16 (6H, 2 × s, 2× CH3), 6,07(1H, d, J = 1,7 Hz, H-5), 6,22 (1H, d, J = 1,7 Hz, H- 7), 6,58 (1H, s, CH), 7,05 (1H, d, J = 8,4 Hz, H-5’), 7,5 (1H, dd, J = 8,4, 1,8 Hz, H-6’), 7,5 (1H, d, J=1,7 Hz, H-2’), 10,8 ( br s, 2 H, 2× OH) 13C-NMR ( DMSO-d6): δ (ppm) 55,5 (2 × CH3), 90,5, 97,6 (C -5, C-7), 102,7 (C-3a), 108,8, 111,9, 113,9 (CH, C-2’, C-5’), 124,4 (C-6’), 125,0 (C-1’), 146,5, 148.6, 149,9 ( C-2, C-3’, C-4’), 158,2, 167,1, 167,5 (C-4, C-6, C-7a), 178,9 (CO). Tổng hợp Z-2-[(4-methoxylphenyl)methyl]-4,6-dihydroxyl-3(2H)- benzofuranone (79)
Tiến hành tương tự phản ứng ngưng tụ giữa 4,6-dihydroxybenzofuran-3(2H)- one (5b, 1,0 mmol) với 4-dimethoxylbenzaldehyde (1,0 mmol) thu được hợp chất
79 là một chất rắn màu vàng, hiệu suất 72 %.
Hợp chất 79 là một chất rắn màu vàng. 1H-NMR(500 MHz, DMSO-d6): δ ( ppm) 3,82 (3H, s, CH3), 6,07(1H, d, J = 1,7 Hz, H-5), 6,59 (1H, s, CH), 6,21 (1H, d, J = 1,7 Hz, H-7), 7,03(1H, d, J = 8,4 Hz, H-5’), 7,05(1H, dd, J = 8,4, 1,8 Hz, H-6’), 7,87 (1H, d, J=1,7 Hz, H-2’), 10,87( br s, 2 H, 2× OH) 13C-NMR ( DMSO-d6): δ (ppm) 55,2 (CH3), 90,4 , 97,6(C -5, C-7), 102,7 (C-3a), 108,4, 114,5, 124,8 (CH, C-2’, C-5’), 132,4 (C-6’), 124,8 (C-1’), 132,4, 146,4, 158,2( C-2, C-3’, C-4’), 160,0, 167,1, 167,6 (C-4, C-6, C-7a), 178,9(CO).
3.2. KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ĐỘC TẾ BÀO CỦA NHỮNG AURONE ĐÃ TỔNG HỢP ĐƯỢC.
Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm
sàng lọc, phát hiện các chất cĩ khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt TBUT ở
điều kiện in vitro. Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Monks
(1991). Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật
độ quang học (OD – Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với
lượng SRB gắn với phân tử protein, do đĩ lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn. Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:
- Chất thử (10 l) pha trong DMSO 10% được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để cĩ nồng độ nồng độ 100g/ml, 20 g/ml; 4 g/ml; 0.8 g/ml; 0.16
g/ml.
- Trypsin hĩa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để
điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm.
- Thêm vào các giếng thí nghiệm lượng tế bào phù hợp (trong 190 l mơi trường) và để chúng phát triển trong vịng từ 2 ngày.
- Một khay 96 giếng khác khơng cĩ chất thử nhưng cĩ TBUT (180l) sẽ được sử dụng làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, đĩa đối chứng ngày 0 sẽ được cố
định tế bào bằng Trichloracetic acid – TCA.
- Sau giai đoạn phát triển trong tủ ấm CO2, tế bào được cố định vào đáy giếng bằng TCA trong 1 giờ, được nhuộm bằng SRB trong 30 phút ở 37 oC. Đổ bỏ SRB và các giếng thí nghiệm được rửa 3 lần bằng acetic acid rồi để khơ
trong khơng khí ở nhiệt độ phịng.
- Cuối cùng, sử dụng 10 mM unbuffered Tris base để hịa tan lượng SRB đã bám và nhuộm các phân tử protein, đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và sử dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết quả về hàm lượng màu của chất nhuộm SRB qua phổ hấp phụ ở bước sĩng 515 nm. Khả năng
sống sĩt của tế bào khi cĩ mặt chất thử sẽ được xác định thơng qua cơng thức sau:
[OD(chất thử) - OD(ngày 0)] x 100 % sống sĩt =
OD(đối chứng âm) - OD(ngày 0) % ức chế = 100% - % sống sĩt
- Các phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine
(Sigma) luơn được sử dụng như là chất đối chứng dương và được thử nghiệm
ở các nồng độ 10 g/ml; 2 g/ml; 0,4 g/ml; 0,08 g/ml.
- DMSO10% luơn được sử dụng như đối chứng âm. Giá trị IC50 (nồng độ ức
chế 50% sự phát triển của tế bào) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve. Chất thử nào cĩ IC50 < 20 g/ml (với chất chiết thơ, hoặc với phân đoạn hĩa học) hoặc IC50 4 g/ml (với hoạt chất tinh khiết) sẽ
được xem là cĩ hoạt tính gây độc tế bào và cĩ khả năng ức chế sự phát triển