III/ KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM
KẾT QUẢ PHÂN LẬP VIRÚT VIÊM GAN VỊT CƯỜNG ĐỘC 1.1 Phân lập trên phôi vịt.
1.1. Phân lập trên phôi vịt.
Từ các mẫu thu thập được từ Đồng Nai, Long An, TP Hồ Chí Minh, chúng tơi đã tiến hành phân lập bằng phương pháp gây nhiễm cho trứng vịt có phơi, kết quả cho thấy các mẫu Navet- V- TG, Navet- V- DN1, Navet- V- DN2 gây chết phôi với tỷ lệ cao biến
động từ 88% - 100%. Vi rút gây chết phôi ở từng thời điểm tương đối ổn định, và số
phôi chết tập trung ở thời điểm 24- 72 giờ. Trong khi đó các mẫu cịn lại (Navet- V- HY2, Navet- V- NB, Navet- V- LA1, Navet- V- LA2) số phôi chết với tỉ lệ thấp 0-4%. Kết quả trình bày ở bảng 1.
Bảng 1.1: Kết quả phân lập vi rút viêm gan vịt trên phôi vịt KH mẫu Độ pha lỗng Liều tiêm Phơi chết/Tổng số tiêm Tỷ lệ %
HY2 1/5 0,2 ml 2/75 2,6 NB 1/5 0,2 ml 1/75 1,3 LA1 1/5 0,2 ml 0/75 0,0 LA2 1/5 0,2 ml 0/75 0,0 TG 1/5 0,2 ml 75/75 100 DN1 1/5 0,2 ml 72/75 96,0 DN1 1/5 0,2 ml 74/75 98,6
Mổ khám các phôi chết của 3 mẫu Navet- V- TG, Navet- V- DN1, Navet- V- DN2 cho thấy bệnh tích trên phơi điển hình bệnh viêm gan vịt với các biểu hiện như: Phù phơi, phơi cịi cọc, xuất huyết trên da nhất là da vùng đầu, gan sưng, xuất huyết lốm đốm trên gan, xuất huyết thành đám thành vệt, lách sưng, thận sưng.
Kiểm tra so sánh bệnh tích ở các các phơi chết cho thấy bệnh tích xuất huyết trên da có ở 100% phơi chết. Phơi chết có bệnh tích trên gan biến động từ 75 – 100 %, đặc biệt ở thời điểm 25-48 giờ bệnh tích xuất huyết gan chiếm tỉ lệ cao nhất là 100%. Ngoài ra các bệnh tích khác thường thấy là phù ở vùng đầu, lưng, dưới da thường có một lượng dịch, khoảng 25% phơi chết có bệnh tích phù phơi và 25% phơi chết có bệnh tích màng nhung niệu sưng dày.
Để xác định mẫu bệnh phẩm và mẫu nước trứng thu được từ các mẫu phân lập có
chứa vi rút viêm gan vịt hay không?, chúng tôi tiến hành gây bệnh thực nghiệm cho vịt mẫn cảm kết quả trình bày ở bảng 2. Kết quả cho thấy sau khi tiêm cho vịt nước trứng nhiễm vi rút hoặc huyễn dịch từ mẫu bệnh phẩm Navet- V- TG, Navet- V- DN1, Navet- V- DN2, vịt đều bị bệnh và chết với tỉ lệ cao. Hầu hết vịt chết có tư thế đặc trưng của
bệnh viêm gan vịt như cổ rụt lại, đầu ngoẹo ra đằng sau, chân duỗi thẳng (còn gọi là
Opisthotonus).
Bảng 1.2: Kết quả gây bệnh thực nghiệm trên vịt
KH mẫu Độ pha lõang Liều tiêm Chết/Tồng số Tỷ lệ % Mẫu bệnh phẩm HY2 1/5 0,5 ml 0/10 0.00 NB 1/5 0,5 ml 0/10 0.00 LA1 1/5 0,5 ml 0/10 0,00 LA2 1/5 0,5 ml 0/10 0,00 TG 1/5 0,5 ml 10/10 100 DN1 1/5 0,5 ml 10/10 100 DN1 1/5 0,5 ml 9/10 90,0 Mẫu nước trứng HY2 1/5 0,5 ml 0/10 2,6 NB 1/5 0,5 ml 0/10 1,3 LA1 1/5 0,5 ml 0/10 0,0 LA2 1/5 0,5 ml 0/10 0,0 TG 1/5 0,5 ml 10/10 100 DN1 1/5 0,5 ml 10/10 100 DN1 1/5 0,5 ml 10/10 100
Theo dõi về thời gian vịt chết cho thấy các chủng Navet- V- TG, Navet- V- DN1, Navet- V- DN2 gây chết vịt chủ yếu trong khoảng thời gian từ 24 giờ đến 48 giờ. Vịt
bệnh, chết có những biểu hiện triệu trứng và bệnh tích giống nhau giữa các mẫu là bệnh phẩm và mẫu gây nhiễm sử dụng nước trứng nhiễm vi rút từ các chủng này.
Vịt con được gây nhiễm với bệnh phẩm từ mẫu Navet- V- TG, Navet- V- DN1, Navet- V- DN2, có các triệu chứng như ủ rũ, mệt mỏi, bỏ ăn, chảy nước mắt, co giật và có xu hướng tụm vào một góc. Vịt chết đều có tư thế ngoẹo đầu và có biểu hiện gan sưng, xuất huyết điểm hay xuất huyết thành vệt, lách sưng và thận sưng.
Trong khi đó vịt con được tiêm bệnh phẩm từ mẫu Navet- V- HY2, Navet- V- NB,
Navet- V- LA1, Navet- V- LA2 và nước trứng từ các mẫu này khơng có biểu hiện triệu chứng của bệnh viêm gan vịt và vịt không chết.
Với kết quả thu được cho thấy các chủng vi rút Navet- V- TG, Navet- V- DN1, Navet- V- DN2 có độc lực cao và ổn định qua các lần thí nghiệm, điều này được chứng minh khi tiến hành xác định liều gây nhiễm, gây chết trên trứng vịt có phơi và trên vịt 2 – 5 ngày tuổi, kết quả trình bày ở bảng 1.3.
Bảng 1.3: Xác định liều EID50, ELD50, LD50 trên trứng và trên vịt
Mẫu EID50/ml ELD50/ml LD50/ml
Navet – V- TG 10-7,0 10-8,0 10-5,8 10-60 10-7,5 10-7,8
Navet – V- DN1 10-7,5 10-7,0 10-5,5 10-5,8 10-7,25 10-7,2
Navet – V – DN2 10-7,2 10-7,6 10-6 10-5,8 10-7,6 10-7,8
Gây nhiễm trên trứng vịt có phơi và vịt con với các nồng độ khác nhau, thí nghiệm
được lập lại 2 lần, kết quả cho thấy vi rút có khả năng thích ứng tốt khi phát triển trên
phôi vịt 12 – 13 ngày tuổi với khả năng gây bệnh và gây chết phôi khá ổn định ở các
chủng khác nhau, với liều EID50 được xác định biến động trong khoảng từ 7,0 – 8,0 log tùy thuộc vào từng chủng nghiên cứu (bảng 1.3). Liều gây chết ELD50 trên phơi cũng khơng có sự khác nhau giữa các chủng khảo sát, biến động trong khỏang 5,8 – 6,0 log. Độc lực của các chủng phân lập cũng được chứng minh thông qua kết quả xác định liều
Để giám định vi rút phân lập được, chúng tôi tiến hành phản ứng RT-PCR dùng
cặp mồi DHV-1F (5’-AAG AAG GAG AAA ATY (C or T) AAG GAA GG-3’) DHV-1R (5’-TTG ATG TCA TAG CCC AAS (C or G) ACA GC-3’) khuếch đại trình tự có kích thước 467 bp trong vùng gene 3D và đặc hiệu cho vi rút viêm gan vịt typ I. Kết quả trình bày ở hình 1.1.
Hình 1.1: Kết quả giám định bằng phương pháp RT-PCR
Hình 1.1.Kết quả điện di RT-PCR DH xác định vi rút. Sản phẩm có kich thước 467bp. Trên bản điện di các lane từ trái sang là: các mẫu kiểm tra từ 1 đến 6; lane 7, 8 positive control cho RT-PCR và chiết tách RNA, lane 9 negative control, lane 10: DNA ladder 100bp. như vậy trong 6 mẫu kiểm tra có 5 mẫu positive, 1 mẫu số 5 negative.
Từ kết quả RT- PCR, một lần nữa khẳng định chắc chắn ba chủng vi rút nghiên
cứu là vi rút cường độc viêm gan vịt.