III/ KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM
1 5 ELISA DTV Công CĐ DTV
XÁC ĐỊNH ĐỘ DÀI BẢO QUẢN VÁCXIN VÀ XÂY DỰNG QUI TRÌNH BẢO QUẢN VẬN CHUYỂN VÁC XIN.
BẢO QUẢN VẬN CHUYỂN VÁC XIN.
4.1. Đặt vấn đề
Độ dài bảo quản của vác xin là một chỉ tiêu kỹ thuật cần thiết phải xác định, đây là
cơ sở để xây dựng qui trình bảo quản (điều kiện và hạn sử dụng) và sử dụng vác xin có hiệu quả, cũng như cơng tác quản lý chất lượng đạt hiệu quả cao.
Theo nguyên tắc thông thường, vác xin được bảo quản ở nhiệt độ 2o – 8oC và thời gian vác xin được bảo quản có thể sử dụng phụ thuộc vào tính chất của kháng ngun chứa trong vác xin cịn có khả năng kích thích miễn dịch khi sử dụng hay hiệu giá vi rút, vi khuẩn cho một liều vác xin vẫn đảm bảo kích thích miễn dịch đối với vác xin sống
(nhược độc). Vì vậy khi xác định thời gian bảo quản của vác xin người ta có thể sử dụng phương pháp kiểm tra vác xin trực tiếp trên động vật qua những giới hạn thời gian bảo quản trong một điều kiện bảo quản đã được xác lập hoặc tiến hành đo hiệu giá vi rút (vi khuẩn) chứa trong vác xin ờ các thời gian bảo quản để xem số lượng vi rút, vi khuẩn còn
đủ cho một liều vác xin nếu sử dụng tiêm phòng. Tuy nhiên,cũng có những nghiên cứu
kết hợp cả hai phương pháp này.
Dựa trên kết quả nghiên cứu trình bày ở nội dung 3 trong dự án này, chúng tôi đã tiến hành xác định thời gian bảo quản của vác xin bảo quản ở nhiệt độ 2o – 8oC, ở các thời gian bảo quản 3, 6, 9 và 12 tháng và dùng phương pháp chuẩn độ để kiểm tra. Ở nội dung này, chúng tơi xin trình bày kết quả xác định thời gian bảo quản của vác xin nhị giá viêm gan và dịch tả vịt.
4.2.1. Nguyên vật liệu thí nghiệm
- Vác xin nhị giá đông khô bảo quản ở 2o – 8oC, sau 3, 6, 9 và 12 tháng bảo quản. - Tế bào CEF sơ cấp một lớp nuôi cấy trên các vỉ nhưa 96 lỗ.
- Các dụng cụ, dung dịch để pha loãng vi rút, các thiết bị để nuôi cấy và kiểm tra tế bào.
4.2.2. Phương pháp thí nghiệm
Thí nghiệm này được thực hiện dựa trên đặc tính sinh học và khả năng trung hòa huyết thanh của các vi rút vác xin để loại bỏ vi rút vác xin còn lại, sau đó thực hiện phương pháp chuẩn độ vi rút trên môi trường nuôi cấy tế bào CEF.
Lấy mẫu vác xin nhị giá đông khô tại các thời điểm nói trên, hồn ngun, xử lý để loại từng loại vi rút. Để bất hoạt vi rút vác xin dịch tả vịt trong vác xin nhị giá, chúng
tôi tiến hành xử lý mẫu vác xin bằng chloroform (5%) trong thời gian 15 phút. Đối với vi rút vác xin viêm gan vịt trong mẫu vác xin nhị giá, chúng tôi sử dụng kháng huyết thanh viêm gan vịt chế bằng phương pháp gây tối miễn trên thỏ phối trộn với vác xin với nồng
độ thích hợp để loại bỏ.
Mẫu sau khi xử lý sẽ được chuẩn độ vi rút theo phương pháp thường qui. Cách
thực hiện được tóm tắt như sau: - Pha loãng mẫu
Chuẩn bị một dãy 7 lọ vô trùng, mỗi lọ chứa 4,5ml môi trường căn bản MEM 2% huyết thanh bê đã được làm lạnh, đánh dấu theo thứ tự từ 1 đến 7. Tiến hành pha loãng mẫu vác xin theo bậc 10 bằng cách: Lấy 0,5ml mẫu vác xin cần chuẩn độ vi rút cho vào lọ thứ 1, lắc đều, sau đó hút 0,5ml từ lọ thứ 1 chuyển sang lọ thứ 2, …cứ thế tiếp tục cho đến lọ thứ 7 và ta có độ pha lỗng của virút như sau: 10-1, 10-2, 10- 3,…….., 10-7 .
- Gây nhiễm tế bào
Vỉ được đánh dấu theo từng nồng độ, mỗi nồng độ dùng 5 lỗ. Dùng pipet tự
động 100ul vô trùng hút mẫu virút đã được pha loãng ở các nồng độ khác nhau, bắt đầu nhiễm từ độ pha loãng thấp nhất đến độ pha cao hơn. Dùng 16 lỗ cho môi
trường căn bản MEM 2% huyết thanh bê làm đối chứng, 100ul/lỗ - Theo dõi tế bào sau gây nhiễm.
V t bào sau khi nhi m s ti p t c đem t m 370C và theo dõi trong th i gian 120 gi . Quan sát tế bào b ng kính hi n vi soi ng c 24 gi sau khi nhi m đ theo dõi t p nhi m và hi n t ng toxic tế bào.
Tiếp tục quan sát tế bào cho đến 120 giờ, ghi nhận những biến đổi bệnh lý tế bào (CPE) ở tất cả các độ pha loãng khác nhau khi so sánh với tế bào đối chứng.
- Xác định hiệu giá virút : Dùng phương pháp Reed-Muench
4.3. Kết quả
4.3.1. Kết quả kiểm tra độ dài bảo quản vác xin nhị giá
Kiểm tra vác xin ở các thời điểm khác nhau: 3, 6, 9, 12 tháng trong điều kiện vác
xin được bảo quản ở 2 – 8oC, với 3 lô được kiểm tra, kết quả cho thấy vác xin nhị giá có
độ dài bảo quản ít nhất 12 tháng kể từ ngày sản xuất. Hiệu giá vi rút cho một liều vác xin
kiểm tra ở thời điểm ngay sau khi đơng khơ khơng có sự sai khác nhiều (khoảng 100,2) khi so sánh với các mẫu được bảo quản ở 2-8oC và kiểm tra ở tháng thứ 9 và 12, kết quả trình bày ở bảng 4.1.
Bảng 4.1: Độ dài bảo quản của vác xin nhị giá viêm gan và dịch tả vịt
Thời gian bảo quản ở 2-8oC Lô vác xin Chuẩn độ vi rút Sau đông khô 3 tháng 6 tháng 9 tháng 12 tháng VGV 10 3,5 10 3,5 10 3,5 10 3,3 10 3,3 LÔ 1 DTV 10 3,2 10 3,3 10 3,3 10 3,1 10 3,0 VGV 10 3,7 10 3,7 10 3,5 10 3,5 10 3,5 LÔ 2 DTV 10 3,5 10 3,5 10 3,5 10 3,3 10 3,3 VGV 10 3,7 10 3,5 10 3,7 10 3,5 10 3,5 LÔ 3 DTV 10 3,3 10 3,3 10 3,1 10 3,1 10 3,0
Kết quả kiểm tra hiệu giá vi rút đã chứng minh tính khoa học và sự thích hợp của công thức phối trộn, dung môi đơng khơ, qui trình đơng khơ và qua kết quả các lơ kiểm tra cũng cho thấy sự ổn định của qui trình sản xuất và các nguyên vật liệu cung cấp để sản xuất vác xin nhị giá viêm gan, dịch tả vịt.