III/ KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM
2.2. Vật liệu và phương pháp thí nghiệm
+ Giống vi rút và tế bào
- Vi rút vác xin chủng DH-EG 2000, dạng nước trứng, giữ ở -80oC, do Bộ môn vi sinh, Khoa thú y, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội cung cấp
- Tế bào CEF sơ cấp một lớp
+ Động vật thí nghiệm
- Vịt con 2 – 3 ngày tuổi, khỏe mạnh, được sinh từ vịt mẹ không chủng vác xin viêm
gan vịt và vịt thí nghiệm được lấy máu kiểm tra kháng thể viêm gan vịt và dịch tả vịt. Vịt có huyết thanh âm tính sẽ được chọn làm thí nghiệm.
Vịt 1 – 1,5 kg, khỏe mạnh, chưa được tiêm vác xin viêm gan vịt và dịch tả vịt và
huyết thanh phải có kết quả kháng thể âm tính với hai loại vi rút trên.
+ Phương pháp thí nghiệm
Phương pháp nuôi cấy tế bào CEF một lớp
- Dùng trứng gà có phơi 9 đến 10 ngày tuổi. Soi và chọn những trứng có phơi phát triển tốt, khoẻ mạnh để làm tế bào.
- Sát trùng trứng bằng cồn iode, dùng kéo cắt vỏ trứng và dùng kẹp lấy phôi ngâm vào dung dịch Hanks’ (hoặc PBSA) có kháng sinh. Cắt bỏ đầu, cánh, chân và phủ tạng, lấy phần thân và ngâm vào dung dịch Hanks’. Rửa thân phôi với dung dịch Hanks’ 3 lần.
- Cắt nhỏ phần thân phôi bằng kéo sau đó cho vào bình có khía có thanh nam châm. Cho dung dịch Hanks’ vào bình khía, 20ml/phơi, lắc xoay vịng để rửa sạch các thân phơi đã được cắt nhỏ. Tiến hành rửa ba lần cho đến khi nước trong.
- Cho dung dịch trypsin 0,25% đã làm ấm trước ở 37oC, với tỷ lệ 20ml/phôi (hoặc 20 lần so với phần tế bào lắng ở đáy), đặt bình khía lên máy khuấy từ và khuấy trong
20 phút ở nhiệt độ 37oC để tách tế bào. Thu hoạch huyễn dịch tế bào vào trong 1
bình thuỷ tinh đặt sẵn trong khay nước đá, thêm một lượng mơi trường MEM có 5% huyết thanh đã làm lạnh với tỷ lệ bằng với lượng trypsin dùng (20ml/phôi) để
ngưng hoạt động của trypsin. Lọc qua vải màn vào bình vơ trùng, ly tâm lạnh với
tốc độ 1500 vòng/phút trong 10 phút. Chắt bỏ phần nước bên trên, cho vào phần cặn tế bào khoảng 100 ml môi trường MEM/phôi, trộn đều nhẹ bằng pipette, đếm tế bào với 0,1% Trypan Blue. Ghi nhận số tế bào có trong huyễn dịch này. Căn cứ vào số lượng tế bào sống thu được pha với môi trường ni cấy (Trong 1 lít mơi trường có 5% huyết thanh bê (NCS). 200.000 đơn vị Penicillin. 100.000 µg Streptomycine, 7,5% Sodium Bicarbonate (NaHCO3). HEPES 1M), điều chỉnh để có có 1 x106 tế bào/ml (hoặc 1 phơi gà pha với 100ml mơi trường phát triển). Tùy mục đích của thí nghiệm, có thể ni cấy tế bào trong chai hoặc vỉ nhựa. Sau khi chia vào các chai,
để tất cả các chai tế bào vào tủ ấm 37oC. Kiểm tra sau 24 – 48 giờ, khi tế bào phát triển thành một lớp chiếm nhiều hơn 80% mặt chai thì có thể sử dụng để sản xuất
vác xin.
Phương pháp tiếp đời
Vi rút vác xin chủng DH-EG 2000 có hiệu giá ELD50 là 106,5/ml , được pha loãng thành các nổng độ 1/50, 1/100. Phương pháp gây nhiễm được thực hiện như
thường qui. Sau khi gây nhiễm kiểm tra CPE hàng ngày. Ở 4 lần tiếp đời đầu tiên, các chai tế bào sau khi gây nhiễm được thu hoạch ở 96 – 120 giờ và tiếp đời liên tục
đế đời thứ 5. Tùy theo kết quả kiểm tra CPE, mẫu sau khi tiếp đời ở các đời thứ 6
trở đi sẽ được chuẩn độ để xác định hàm lượng vi rút và tính ổn định của chủng vác xin khi thích ứng trên tế bào
Phương pháp chuẩn độ vi rút trên tế bào
Tất cả các hóa chất, dụng cụ và thao tác trong q trình nhiễm virút trên mơi trường ni cấy tế bào đều được thực hiện trong điều kiện vô trùng.
- Pha loãng vi rút
Chuẩn bị một dãy 7 lọ vô trùng, mỗi lọ chứa 4,5ml môi trường căn bản MEM 2% huyết thanh bê đã được làm lạnh, đánh dấu theo thứ tự từ 1 đến 7.
Lấy 0,5ml mẫu virút cần chuẩn độ cho vào lọ thứ 1, lắc đều, sau đó hút 0,5ml từ lọ thứ 1 chuyển sang lọ thứ 2, …… cứ thế tiếp tục cho đến lọ thứ 7 và ta có độ pha lỗng của virút như sau: 10-1, 10-2, 10-3,…….., 10-7 .
- Nhiễm tế bào
Vỉ được đánh dấu theo từng nồng độ, mỗi nồng độ dùng 4 lỗ. Dùng pipet tự
động 100ul vô trùng hút mẫu virút đã được pha loãng ở các nồng độ khác nhau, bắt đầu nhiễm từ độ pha loãng thấp nhất đến độ pha cao hơn. Dùng 16 lỗ cho môi
trường căn bản MEM 2% huyết thanh bê làm đối chứng, 100ul/lỗ - Theo dõi tế bào sau gây nhiễm.
Vỉ tế bào sau khi nhiễm sẽ tiếp tục đem ấp ở tủ ấm 370C và theo dõi trong thời gian 120 giờ. Quan sát tế bào bằng kính hiển vi soi ngược 24 giờ sau khi nhiễm để theo dõi tạp nhiễm và hiện tượng toxic tế bào.
Tiếp tục quan sát tế bào cho đến 120 giờ, ghi nhận những biến đổi bệnh lý tế bào (CPE) ở tất cả các độ pha loãng khác nhau khi so sánh với tế bào đối chứng. - Xác định hiệu giá virút: Dùng phương pháp Reed-Muench