III/ KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM
2.3 Kết quả thí nghiệm
2.3.1 Thích ứng vi rút viêm gan vịt chủng DH – EG 2000 trên tế bào xơ phôi gà.
Thí nghiệm gây nhiễm vi rút vác xin chủng DH-EG 2000 trên 3 lọai tế bào sơ cấp: tế bào thận, tế bào gan và tế bào xơ phôi gà, và theo rõi khả năng phát triển của vi rút này trên các tế bào thí nghiệm. Kết quả cho thấy vi rút có khả năng nhân lên tốt trên tế bào xơ phôi gà và thực tế cho thấy loại tế bào này thuận tiện hơn cho việc nghiên cứu sản xuất vác xin.
Mặc dù vi rút cũng có thể nhân lên trên các loại tế bào khác như tế bào gan, thận, nhưng sự phát triển không được ổn định biểu hiện cả về hiệu giá vi rút thu được cũng như sự phát triển của bản thấn tế bào thận, gan sơ cấp khi tiến này ni cấy cịn thiếu sự ổn định. Mặt khác khi nuôi cấy tế bào thận và gan địi hỏi về mơi trường và phương pháp tiến hành khá phức tạp, điều này sẽ rất khó khăn trong việc áp dụng vào sản xuất lớn.
Bệnh tích tế bào được phát hiện ở lần tiếp đời thứ 4 khi nhiễm vi rút vác xin
chủng DH-EG 2000 lên tế bào xơ phôi gà và mức độ gây bệnh tích tế bào (CPE –
Cytopathic Effect) tăng dần theo số lần tiếp đời, kèm theo hiệu giá vi rút cũng tăng dần và đạt được độ ổn định ở lần tiếp đời thứ 9 và thứ 10.
Kiểm tra hiệu giá vi rút ở lần tiếp đời thứ 5, cho thấy huyễn dịch vi rút có hiệu giá là TCID50 = 105,3, và hiệu giá virut có biểu hiện tăng dần sau lần tiếp đời thứ 6, 7, 8 và ở lần tiếp đời thứ 8, hiệu giá vi rút đã đạt được 106 TCID 50 và duy trì được ở mức
độ ổn định (bảng 2.1).
Bảng 2.1: Kết quả thích ứng vi rút viêm gan vịt trên tế bào xơ phôi gà
Đời cấy truyền
trên tế bào CEF Độ pha loãng
Thời điểm thu hoạch
Hiệu giá virút (TCID50)/ml CEF1 1/5 120 giờ ND CEF2 1/5 120 giờ ND CEF3 1/5 120 giờ ND CEF4 1/10 96 giờ ND CEF5 1/5 - 1/10 96 giờ 10 5,3 CEF6 1/10 - 1/50 96 giờ 10 5,7 CEF7 1/10 - 1/50 96 giờ 10 6,0 CEF8 1/10 - 1/50 72 giờ 10 6,0 CEF9 1/50 - 1/100 72 giờ 10 6,3 CEF10 1/50 - 1/100 72giờ 10 6,5 CEF11 1/500 - 1/1000 72 giờ 10 6,7
2.3.2. Kiểm tra tính an toàn và miễn dịch của giống DH – EG 2000 TB
Để kiểm tra tính sinh miễn dịch của vi rút vác xin DH-EG 2000 thích ứng trên tế
bào ( kí hiệu: DH-EG 2000 TB) chúng tơi đã tiến hành gây miễn dịch cho vịt 2 ngày tuổi. Mẫu được pha loãng bậc 10 và mỗi nồng độ gây miễn dịch cho 7 vịt, cùng với
một lô tiêm PBS để làm đối chứng. Theo dõi phản ứng của vịt sau khi tiêm giống vác xin 7 ngày để đánh giá tính an tồn. Ở ngày tuổi thứ 14 sau khi tiêm vác xin, vịt miễn dịch và đối chứng được thử thách cường độc với chủng VGV cường độc liều 103
LD50/con, kết quả được trình bày ở bảng 2.2.
Bảng 2.2: Kết quả kiểm tra tính an tồn và tính sinh miễn dịch của giống vi rút HD –EG 2000 TB
Độ pha
loãng
Hiệu giá Virút giống vác xin
(TCID50/ml)
Số vịt tiêm (con)
Vịt có phản ứng hoặc chết sau khi
tiêm VX 7 ngày Số chết/tổng số cơng độc Thí nghiệm lần 1 10o 106,7 7 0 0/7 10-1 105,7 7 0 1/7 10-2 104,7 7 0 0/7 10-3 103,7 7 0 1/7 10-4 102,7 7 0 2/7 10-5 101,7 7 0 4/7 ĐC Tiêm PBS 7 0 6/7 Thí nghiệm lần 2 10o 106,7 7 0 0/7 10-1 105,7 7 0 0/7 10-2 104,7 7 0 1/7 10-3 103,7 7 0 1/7 10-4 102,7 7 0 2/7 10-5 101,7 7 0 4/7 ĐC Tiêm PBS 7 0 6/7
Theo dõi sau khi tiêm giống vác xin DH-EG 2000 TB cho vịt ở các nồng độ
khác nhau cho thấy khơng có vịt bị chết do vi rút viêm gan vịt hoặc có những biểu hiện bất thường nào. Vịt ăn uống khỏe mạnh và phát triển bình thường ở tất cả các nồng độ thí ngiệm. Kết quả đã chứng minh giống vi rút vác xin VGV sau khi thích ứng trên tế bào đảm bảo tính an tồn cho vịt, thậm trí khi tiêm với liều rất cao 106,7 TCID50.
Tiến hành công thử thách cường độc cho các vịt được miễn dịch với các nồng độ vi rút khác nhau, theo dõi tỷ lệ sống chết và tính tính tốn liều PD50 theo Reed-
Muench chúng tối đã xác định được liều PD50 của giống DH-EG 2000 TB là 10-4,7, tương đương 102 TCID50/0,5ml
Căn cứ vào liều PD50 xác định được, chúng tơi thí nghiệm gây miễn dịch cho
vịt với liều lớn hơn khỏang 100 TCID50 cho 10 vịt 2 ngày tuổi và 10 vịt không tiêm vác xin làm đối chứng. Ở ngày tuổi thứ 14 sau khi tiêm vác xin, vịt miễn dịch và đối chứng
được thử thách cường độc với chủng VGV cường độc liều 103 LD50/con, kết quả qua 2 lần thí nghiệm được trình bày ở bảng 3
Bảng 3: Kết quả kiểm tra miễn dịch giống vi rút vác xin DH-EG 2000 TB trên vịt
Lần thí
nghiệm Lơ thí nghiệm Số vịt tiêm Tỷ lệ bảo hộ (%)
DH-EG 2000 TB 10 7/10 (70%)
I Đối chứng 10 2/10 (20%)
DH-EG 2000 TB 10 8/10 (80%)
II Đối chứng 10 2/10 (20%)
Kết quả cho thấy vi rút chủng vác xin DH-EG 2000 TB vẫn bảo tồn được tính kháng nguyên sau khi tiếp đời trên tế bào xơ phôi gà biểu hiện vịt sau khi được gây
miễn dịch bằng chủng vi rút này đã có đáp ứng miễn dịch khá tốt, với tỷ lệ bảo hộ đạt từ 70 - 80 % sau khi thử thách bằng cường độc, trong khi vịt đối chứng chết 80 %.
Bằng phương pháp gây miễn dịch cho vịt lớn, sau đó lấy huyết thanh của vịt miễn dịch kiểm tra đáp ứng miễn dịch bằng phương pháp bảo hộ thụ động trên vịt con 2 – 3 ngày tuổi hay tiến hành phản ứng trung hòa trên tế bào, kết quả cho thấy vịt con
được gây miễn dịch bằng huyết thanh vịt miễn dịch với vi rút DH-EG 2000 TB bảo hộ được vịt khi thử thách bằng cường độc VGV với liều 103 LD50/vịt.
2.3.3. Sản xuất vác xin và đánh giá ảnh hưởng về miễn dịch giữa hai chủng vác xin dịch tả vịt và viêm gan vịt.
Căn cứ trên liều gây miễn dịch của vi rút vác xin dịch tả vịt (DTV –TB) và vi rút vác xin viêm gan vịt chủng DH – EG 2000- TB, chúng tôi đã phối trộn hai chủng vi rút
vác xin này với tỷ lệ 1:1 để sản xuất vác xin nhị giá với 200 liều/lọ và 1 liều vác xin chứa khơng ít hơn 103TCID50 đối với vi rút DTV –TB và 103,5 TCID50 đối với vi rút
DH-EG 2000-TB. Vác xin được chế tạo ở dạng đông khô đảm bảo các tiêu chuẩn vật lý như: Tạo thành bánh xốp, khơng dính thành, màu trắng vàng, độ ẩm < 3% và đạt tiêu chuẩn chân khơng khi kiểm tra bằng phương pháp đèn khị.
Để kiểm tra xem việc phối trộn hai loại vi rút (DTV –TB và DH – EG 2000-TB)
có ảnh hưởng đến khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch của mỗi loại vi rút vác xin
hay khơng, chúng tơi thí nghiệm gây miễn dịch trên vịt con 2 ngày tuổi với bố trí thí nghiệm như sau:
Một tổng số 80 vịt 2 ngày tuổi khỏe mạnh được chia làm 8 nhóm, mỗi nhóm 10 vịt. Nhóm 1 tiêm chỉ vác xin dịch tả vịt với liều 103 TCID50/con; nhóm 2 tiêm chỉ vác xin viêm gan vịt chủng DH –EG 2000 TB liếu 103,5TCID50; nhóm 3a tiêm vác xin dịch tả vịt và viêm gan vịt trộn chung và 3b tiêm vác xin dịch tả vịt và viêm gan vịt nhưng ở hai vị trí khác nhau; nhóm 4a tiêm vác xin dịch tả vịt và viêm gan vịt trộn chung và 4b tiêm vác xin nhị giá dịch tả vịt và viêm gan vịt riêng từng loại. Sau 12 ngày miễn dịch, nhóm 1, 3a, 4a và 10 vịt không tiêm vác xin được công với vi rút dịch tả vịt cường độc liều 103EID50/vit (TCN 183-93), và nhóm 2, 3b, 4b cùng với 10 đối chứng không tiêm vác xin được công với vi rút viêm gan vịt cường độc liều 103LD50. Kết quả trình bày ở bảng 4.
Kết quả bảng 4 chứng minh rằng khi tiêm vác xin dịch tả vịt và viêm gan vịt kết hợp ở cùng một vị trí hay khác vị trí trên vịt đều cho đáp ứng miễn dịch giống với khi
tiêm hai loại vác xin này riêng rẽ. Điều này chứng tỏ khơng có sự ảnh hưởng khơng có
lợi giữa hai loại vi rút vác xin DTV và VGV về phương diện kích thích đáp ứng miễn
dịch khi tiêm kết hợp nhưng ở các vị trí khác nhau hoặc cùng một vị trí. Như vậy có thể phối trộn vi rút vác xin DTV và VGV để sản xuất vác xin nhị giá mà không ảnh hưởng
đến chất lượng gây đáp ứng miễn dịch của từng loại vi rút vác xin khi tiêm miễn dịch trên
vịt.
Bằng phương pháp công cường độc cho vịt miễn dịch với vác xin nhị giá DTV và VGV, và kiểm tra đáp ứng miễn dịch thơng qua phản ứng trung hịa Toth, 1970 kết luận vác xin nhị giá dịch tả vịt và viêm gan vịt đã kích thích cơ thể tạo ra một trạng thái miễn
dịch tốt chống lại vi rút cường độc DTV và VGV và khơng có sự khác nhau về đáp ứng miễn dịch giữa tiêm vác xin nhị giá và vác xin chỉ chứa vi rút DTV hoặc VGV.
Bảng 4: Đánh giá đáp ứng miễn dịch của vi rút vác xin DTV và vi rút vác xin VGV với các cách gây miễn dịch khác nhau
Lơ thí nghiệm Liều tiêm Số lượng vịt Vi rút công độc Tỷ lệ bảo hộ (%) 1 10 3 TCID50/con* 10 80 (8/10) 3a 10 3 TCID50/con và 103,5 TCID50/con 10 80 (8/10) 4a 10 3 TCID50/con và 103,5 TCID50/con 10 100 (10/10)
Đối chứng Không tiêm 10
Dịch tả vịt 0 (0/10) 2 103,5 TCID50/con** 10 80 (8/10) 3b 10 3 TCID50/con và 103,5 TCID50/con 10 90 (9/10) 4b 10 3 TCID50/con và 103,5 TCID50/con 10 100 (10/10)
Đối chứng Không tiêm 10
Viêm gan
vịt
30 (3/10) **103,5 TCID50/con (Viêm gan vịt); *10 3 TCID50/con (Dịch tả vịt **103,5 TCID50/con (Viêm gan vịt); *10 3 TCID50/con (Dịch tả vịt
2.4. Kết luận
- Chủng virút vắcxin Viêm gan vịt DH-EG-2000 thích ứng trên môi trường nuôi cấy tế
bào CEF sơ cấp một lớp có khả năng kích thích vịt đáp ứng miễn dịch và bảo hộ được với virút cường độc gây bệnh Viêm gan vịt.
- Thí nghiệm chứng tỏ vi rút vác xin dịch tả vịt khi phối trộn với vi rút vác xin viêm gan vịt và tiêm phịng cho vịt khơng có ảnh hưởng về mặt sinh miễn dịch.
- Đã sản xuất thử nghiệm vắcxin nhị giá đông khô bao gồm cà 2 chủng virút vắcxin
Dịch tả vịt và viêm gan vịt trên tế bào và chất lượng của vác xin được trình bày tại nội dung 3.
NỘI DUNG 3