dấu buồng hơi, vị trí phơi. Sát trùng tồn bộ phần vỏ bằng cồn 70o, sát trùng vùng buồng hơi bằng cồn iod 5%.
- Tiêm trứng: Đục 1 lỗ trên đỉnh buồng hơi bằng dùi tiêm trứng, dùng syringe 1ml hút mẫu huyễn dịch (chuẩn bị như miêu tả ở trên) , tiêm với liều 0,2 ml/trứng. Dùng
parafin hàn kín lỗ tiêm, để trứng vào khay và cho vào tủ ấm 37oC ấp tiếp.
- Theo dõi trứng sau 18, 24, 48, 72, 96 giờ, kiểm tra phơi trứng sống chết. Những quả có phơi chết trong thời gian theo dõi và những thai sống sau 96 giờ cho vào tủ lạnh 4oC trong 8- 12 giờ. Sau đó mổ trứng thu nước trứng và kiểm tra bệnh tích phơi. Các mẫu nước trứng được bảo quản ở -80oC. Mẫu thu từ nước trứng sau đó được dùng để xác định sự hiện diện của vi rút viêm gan vịt bằng phương pháp gây nhiễm cho vịt và giám định vi rút dùng kỹ thuật RT- PCR.
3.2. Phương pháp nuôi cấy tế bào CEF một lớp
- Dùng trứng gà có phơi 9 - 10 ngày tuổi. Soi và chọn những trứng có phơi phát triển tốt, khoẻ mạnh để làm tế bào.
- Sát trùng trứng bằng cồn iode, dùng kéo cắt vỏ trứng và dùng kẹp lấy phôi ngâm vào dung dịch Hanks’ (hoặc PBS) có kháng sinh. Cắt bỏ đầu, cánh, chân và phủ
tạng, lấy phần thân và ngâm vào dung dịch Hanks’. Rửa thân phôi với dung dịch Hanks’ 3 lần.
- Cắt nhỏ phần thân phơi bằng kéo sau đó cho vào bình có khía có thanh nam châm. Cho dung dịch Hanks’ vào bình khía, 20ml/phơi, lắc xoay vịng để rửa sạch các thân phôi đã được cắt nhỏ. Tiến hành rửa ba lần cho đến khi nước trong.
- Cho dung dịch trypsin 0,25% đã làm ấm trước ở 37oC, với tỷ lệ 20ml/phôi (hoặc 20 lần so với phần tế bào lắng ở đáy), đặt bình khía lên máy khuấy từ và khuấy trong 20 phút ở nhiệt độ 37oC để tách tế bào. Thu hoạch huyễn dịch tế bào vào trong 1 bình thuỷ tinh đặt sẵn trong khay nước đá, thêm một lượng mơi trường MEM có 5% huyết thanh đã làm lạnh với tỷ lệ bằng với lượng trypsin dùng (20ml/phôi) để ngưng hoạt động của trypsin. Lọc qua vải màn vào bình ly tâm, ly tâm lạnh với tốc độ 1500
vòng/phút trong 10 phút.
- Chắt bỏ phần nước bên trên, cho vào phần cặn tế bào khoảng 100 ml môi trường MEM/phôi, trộn đều nhẹ bằng pipette, đếm tế bào với 0,1% Trypan Blue. Ghi nhận số tế bào có trong huyễn dịch này. Căn cứ vào số lượng tế bào sống thu được pha với môi trường ni cấy (Trong 1 lít mơi trường có 5% huyết thanh bê, 200.000 đơn vị Penicillin, 100.000 µg Streptomycine, 7,5% Sodium Bicarbonate (NaHCO3), HEPES 1M), điều chỉnh để có 1 x106 tế bào/ml (hoặc 1 phôi gà pha với 100ml mơi trường phát triển). Tùy mục đích của thí nghiệm, có thể ni cấy tế bào trong chai hoặc vỉ nhựa. Sau khi chia vào các chai, để tất cả các chai tế bào vào tủ ấm 37oC. Kiểm tra sau 24 – 48 giờ, khi tế bào phát triển thành một lớp chiếm nhiều hơn 80% mặt chai thì có thể sử dụng để sản xuất vác xin.
3.3. Giám định chủng vi rút cường độc viêm gan vịt phân lập được bằng phản ứng RT-PCR RT-PCR
Các mẫu vi rút phân lập được từ bệnh phẩm, để khẳng định chắc chắn đó là vi rút viêm gan vịt chúng tôi sử dụng cặp mồi dùng cho phản ứng PCR thu nhận gen 3D bao gồm: mồi xuôi DHAV-1F và mồi ngược DHAV-1R, được thiết kế dựa trên trình tự chuỗi gen của các chủng DHAV-1 và cho sản phẩm PCR khoảng 467 bp.
Để thực hiện giám định vi rút viêm gan vịt, nước trứng và gan vịt chết sau khi gây
(QIA – amp Viral Mini Kit, thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất và bảo quản ở - 20oC cho đến khi sử dụng.
3.4. Khảo sát một số đặc tính sinh học của chủng vi rút cường độc viêm gan vịt phân lập được. lập được.
3.4.1. Phương pháp xác định một số đặc tính sinh học của chủng vi rút cường độc viêm gan vịt phân lập được khi gây nhiễm trên vịt. viêm gan vịt phân lập được khi gây nhiễm trên vịt.
+ Phương pháp xác định LD50 của vi rút cường độc viêm gan vịt.
- Thí nghiệm được tiến hành vịt 5-7 ngày tuổi khoẻ mạnh và chưa được miễn dịch với vi rút viêm gan vịt, mỗi lần tiêm cho 40 vịt/mẫu và có 4 vịt làm đối chứng.
- Mẫu vi rút là nước trứng thu họach của những phôi chết từ 24 - 96 và đã được xác định là vi rút viêm gan vịt bằng kỹ thuật PCR. Mẫu được pha thành các nồng độ từ
10-1 ÷ 10-10. Lấy 10 ống nghiệm vô trùng đánh số lần lượt từ 1 – 10, cho vào mỗi ống
4,5ml nước sinh lý. Hút 0,5ml nước trứng vào ống nghiệm 1 và xử lý kháng sinh, trộn
đều. Sau đó hút 0,5ml ở ống 1 cho vào ống 2 và trộn đều. Làm tiếp tục cho đến ống thứ
10 ta sẽ được các nồng độ 10-1 ÷ 10-10.
- Tiêm vịt: mỗi nồng độ pha loãng tiêm 4 con với liều 0,5ml/con vào bắp lườn, vịt
đối chứng tiêm 0,5ml nước sinh lý. Theo dõi trong 10 ngày để quan sát những triệu
chứng lâm sàng, xác định số con chết ở các thời điểm theo từng nồng độ. Những vịt chết mổ khám kiểm tra bệnh tích. Số liệu thu được, tính tốn xác định liều LD50 theo Reed- Muench
3.4.2. Phương pháp xác định một số đặc tính sinh học của chủng vi rút cường độc viêm gan vịt phân lập được trên phôi. viêm gan vịt phân lập được trên phôi.
+ Phương pháp xác định chỉ số EID50 của vi rút cường độc viêm gan vịt.
Thí nghiệm được tiến hành 2 lần/mẫu, mỗi lần pha giống vi rút kiểm tra thành 10 nồng độ 10-1 ÷ 10-10 với dung dịch đệm PBS vô trùng. Mỗi nồng độ tiêm 4 phôi liều
0,2ml/phôi và 4 phôi không tiêm để làm đối chứng.
Sau khi tiêm trứng, theo dõi phôi chết vào các thời điểm 18, 24, 48, 72, 96 giờ,
kiểm tra số phôi chết ở mỗi nồng độ. Những phôi chết cho vào tủ lạnh 4oC/8-12 giờ. Mổ trứng, thu nước trứng và kiểm tra bệnh tích phơi. Tính tốn EID50 theo công thức của Reed - Muench.
+ Phương pháp xác định chỉ số ELD50 của vi rút cường độc viêm gan vịt.
Giống vi rút kiểm tra được thành 8 nồng độ 10-1 ÷ 10-8 với dung dịch đệm PBS vô trùng. Mỗi nồng độ tiêm 4 phôi liều 0,2ml/phôi và 4 phôi không tiêm để làm đối chứng. Sau khi tiêm trứng, theo dõi phôi đến 96 giờ. Kiểm tra và cho những phôi chết vào tủ lạnh 4oC. Sau 96 giờ cho toàn bộ trứng vào tủ lạnh 4oC/8-12giờ. Mổ trứng và kiểm tra bệnh tích của phơi. Tính tốn ELD50 theo cơng thức của Reed - Muench.
3.4.3. Phương pháp khảo sát tính tương đồng kháng nguyên giữa chủng vi rút
cường độc viêm gan vịt phân lập được và vi rút nhược độc viêm gan vịt chủng DH - EG - 2000 thông qua phản ứng trung hòa trên vịt.
+ Phản ứng trung hòa: Theo phương pháp huyết thanh cố định và vi rút pha
loãng:
- Huyết thanh miễn dịch: vịt lớn 10 con, khỏe mạnh và chưa được tiêm vác xin. Tiêm vác xin Viêm gan vịt chủng DH - EG - 2000 cho chúng, tiêm 2 lần cách nhau 1 tuần sau 21 ngày lấy máu chắt huyết thanh.
- Huyết thanh đối chứng: vịt lớn, khỏe mạnh và chưa được tiêm vác xin. Nuôi trong
cùng điều kiện và không được tiêm vác xin Viêm gan vịt chủng DH - EG – 2000 - Giống vi rút: là nước trứng đã chuẩn bị ở trên. Pha loãng vi rút thành các nồng độ 10-1
đến 10-6 với nước sinh lý đã xử lý kháng sinh.
Phương pháp tiến hành
- Lơ thí nghiệm: Trộn kháng huyết thanh miễn dịch viêm gan vịt với các nồng độ vi rút
đã pha lỗng theo tỉ lệ 1:1.
- Lơ đối chứng: Trộn huyết thanh đối chứng với các nồng độ vi rút đã pha loãng theo tỉ lệ 1:1.
- Ủ hỗn hợp trên ở nhiệt độ 370C/1h.
Thực hiện gây nhiễm trứng:
- Tiêm hỗn hợp trên vào xoang niệu mô phôi trứng (0.2ml/phôi), 5 phôi/nồng độ. - Phôi được ấp tiếp ở tủ ấp 370C trong 10 ngày. Loại bỏ những phơi chết trước 24h.
+ Đánh giá kết quả:
Tính tốn chỉ số trung hòa NI - Neutralization index, Nguyễn Như Thanh, 2006 . Nếu kết quả phân lập và giám định dương tính với kháng huyết thanh chuẩn, kết luận có
sự tương đồng kháng nguyên giữa chủng vi rút cường độc viêm gan vịt phân lập được và vi rút nhược độc viêm gan vịt chủng DH - EG – 2000
3.5. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu nghiên cứu được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học và bằng
chương trình EXCEL trên máy tính.