CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN
1.6. Các phƣơng pháp phân tích đánh giá cây chuyển gen invitro và in vivo
Các vector chuyển gen đều đƣợc thiết kế hệ thống gen chọn lọc kèm theo gen đích cho phép chọn lọc các mô, cây mang gen ở giai đoạn sớm bằng biểu hiện kháng của gen đó với các chất chọn lọc. Các gen chọn lọc có thể là các gen kháng kháng sinh, kháng thuốc diệt cỏ, gen chỉ thị màu hoặc gen chuyển hóa các cơ chất chọn lọc. Thực chất phân tích tính kháng của chất chọn lọc (kháng sinh, chất diệt cỏ) là chọn dịng tế bào, mơ và cây mang tính kháng với chất chọn lọc thông qua hoạt động của gen chuyển. Chất chọn lọc có thể là kháng sinh nhƣ kanamycin khi dùng gen nptII hay hygromycine khi dùng gen hpt hoặc thuốc diệt cỏ basta khi dùng gen bar. Bƣớc phân tích này có thể áp dụng cho mọi giai đoạn sau khi biến nạp từ trạng thái đơn bào đến mơ sẹo, chồi tái sinh, cây hồn chỉnh hay cây non gieo từ hạt và có thể tiến hành in vitro hoặc in vivo.
Cách thức tiến hành: Bổ sung chất chọn lọc theo nồng độ nhất định vào môi trƣờng ni cấy sau đó quan sát ảnh hƣởng lên đối tƣợng chọn lọc là mô hoặc cây. Đối với các mô không mang gen chuyển biểu hiện thƣờng thấy là mất khả năng tạo lục lạp, mô chuyển nâu đen và chết. Đối với các chồi không mang gen chuyển sẽ không tạo đƣợc rễ dù đƣợc chuyển sang mơi trƣờng có nồng độ chất kích thích ra rễ cao do bộ rễ rất nhạy cảm với chất chọn lọc.
1.6.2. Phân tích cây chuyển gen bằng kỹ thuật sinh học phân tử
Khi đƣợc biến nạp vào tế bào, gen ngoại lai có thể tồn tại trong tế bào chủ ở ba trạng thái: trạng thái tạm thời ở dạng DNA tự do; trạng thái lâu dài dƣới dạng một thể plasmid có khả năng nhân lên độc lập hoặc trạng thái ổn định nhƣ một đoạn
DNA của genome tế bào chủ. Khi tạo cây trồng biến đổi gen trạng thái đƣợc mong muốn nhất chính là trạng thái ổn định của gen ngoại lai trong tế bào chủ bởi tính bền vững của nó. Khi gen ngoại lai tồn tại ổn định trong genome tế bào chủ và đƣợc phiên mã, dịch mã cùng genome tế bào để biểu hiện tính trạng mong muốn thì q trình chuyển gen tạo sinh vật biến đổi gen mới đƣợc coi là thành cơng. Chính vì thế, việc sử dụng các biện pháp sinh học phân tử nhằm kiểm tra sự có mặt cũng nhƣ mức độ biểu hiện của gen đó trong tế bào là bƣớc làm cần thiết và quan trọng trong q trình tạo sinh vật biến đổi gen nói chung và cây trồng biến đổi gen nói riêng.
1.6.2.1. Phân tích cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR
Trong phân tích cây chuyển gen, gen chuyển đã đƣợc biết trình tự vì vậy chỉ cần sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho gen đó và tách chiết DNA từ mẫu thực vật cần xác định làm khn là có thể tiến hành PCR (Polymerase chain reaction). Sử dụng plasmid mang gen chuyển làm đối chứng dƣơng, nếu sản phẩm PCR khi điện di có kích thƣớc đúng nhƣ dự kiến và bằng với đối chứng thì mẫu phân tích đƣợc coi là dƣơng tính.
Tuy nhiên, kết quả PCR dƣơng tính khơng đồng nghĩa với việc quá trình chuyển gen đã thành cơng, do trong một số trƣờng hợp mà gen không đƣợc chuyển vào genome tế bào chủ nhƣng vẫn xuất hiện trong DNA tổng số của mẫu phân tích: (1) Có thể do vi khuẩn A. tumefaciens mang gen mục tiêu vẫn còn tồn tại trong khối mơ hay trong gian bào của các mẫu phân tích, gen mục tiêu hồn tồn chƣa đƣợc chuyển vào hệ gen vật chủ. Hiện tƣợng này gọi là hiện tƣợng dƣơng tính giả. Nếu mẫu phân tích là của lồi thực vật đã trải qua nhân giống hữu tính thì trƣờng hợp này đƣợc loại trừ. (2) Gen chuyển tồn tại tự do trong tế bào chất tức có thể biến mất qua sinh sản hữu tính, gen chuyển khơng đƣợc di truyền lại nên quá trình chuyển gen khơng có ý nghĩa. (3) Gen chuyển tuy đã gắn vào genome tế bào nhƣng lại không đƣợc biểu hiện do nhiều lý do, do đó cây khơng thể hiện đƣợc tính trạng mong muốn. Vì các lý do trên mà kết quả của phản ứng PCR chỉ có giá trị định hƣớng ban đầu cho q trình đánh giá, phân tích cây trồng biến đổi gen. Tuy nhiên,
nó vẫn một kỹ thuật hữu ích trong việc phân tích cây chuyển gen nhờ khả năng nhân nhanh một cách chính xác các đoạn DNA quan tâm.
1.6.2.2. Phân tích cây chuyển gen bằng phương pháp Southern blot
Trong xác định cây chuyển gen, kỹ thuật lai Southern blot là phƣơng pháp tin cậy và thông dụng nhất và đƣợc ứng dụng nhằm xác định số bản copy trong cây chuyển gen. Ngoài việc khẳng định sự tồn tại của gen chuyển trong genome cây nhận thông qua lai DNA tổng số của mẫu phân tích với DNA mẫu dị, lai Southern cịn cho biết số lƣợng bản sao đã đƣợc đƣa vào cây nhận thơng qua số lƣợng băng vạch dƣơng tính trên phim.
1.6.3. Đánh giá khả năng sinh trƣởng của cây chuyển gen
Để đánh giá một quá trình nhân giống cũng nhƣ chọn tạo các dịng thực vật mới chuyển gen có thành cơng hay khơng, địi hỏi cây con phải thích nghi đƣợc với điều kiện tự nhiên, sinh trƣởng phát triển tốt. Tùy thuộc vào đặc tính tính trạng của gen chuyển mà các phƣơng pháp phân tích có thể khác nhau. Đối với tính kháng virus, kháng vi khuẩn hay kháng nấm đƣợc thử bằng cách lây nhiễm nhân tạo tại các phịng thí nghiệm về bệnh học thực vật với các chủng virus, vi khuẩn hoặc nấm. Sau đó, để khẳng định chính xác tính kháng cần thực hiện bƣớc tiếp theo là kiểm tra tính kháng trên đồng ruộng có lây nhiễm nhân tạo. Đối với tính trạng là tính chống chịu thƣờng đƣợc kiểm tra bằng thí nghiệm gây điều kiện ngoại cảnh bất lợi nhân tạo, tuy nhiên đây là việc làm tƣơng đối khó khăn, bởi vì điều kiện bất lợi ngồi tự nhiên ln đan xen, dễ thay đổi và khó dự báo trƣớc. Đối với các gen cải tiến chất lƣợng cây trồng hoặc gen sinh trƣởng nhanh các phân tích đƣợc tiến hành tƣơng đối dễ dàng. Khi quan tâm đến tính trạng chất lƣợng nào và chuyển những gen phù hợp thì sẽ tiến hành các phân tích về chỉ tiêu chất lƣợng đó, ví dụ tăng hàm lƣợng β- carotene thì phân tích trực tiếp hàm lƣợng chất này bằng khối phổ, tăng chất lƣợng tinh bột, tăng độ dẻo của hạt gạo thì xác định hàm lƣợng amylose. Đối với gen GS1 tăng cƣờng hiệu quả đồng hóa và tái sử dụng nitơ giúp cây sinh trƣởng nhanh các chỉ tiêu sinh trƣởng nhƣ đƣờng kính thân, chiều cao cây, diện tích lá có thể coi là một thƣớc đo so sánh giữa cây chuyển gen và cây đối chứng không chuyển gen.