CHƢƠNG 2 : ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng, phạm vi nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu thực vật
Cây xoan ta tam bội đƣợc lựa chọn làm đối tƣợng nghiên cứu nhờ các đặc điểm về tăng số lƣợng thể nhiễm sắc có thể làm tăng thêm các tổ hợp gen mới và tăng khả năng biến dị, tăng tính thích ứng với mơi trƣờng mới (Gill và Singhall, 1998). Cây xoan ta tam bội tạo đƣợc dòng bất thụ do quá trình phân bào giảm nhiễm diễn ra khơng bình thƣờng, phần lớn các giao tử mang số nhiễm sắc thể trung gian n và 2n nên khơng có sức sống. Vì thế, việc sử dụng cây xoan ta tam bội trong chọn giống cây trồng nhằm tạo những cây trồng mới có đặc điểm tốt và có khả năng sinh trƣởng mạnh chất lƣợng tốt phù hợp với nhu cầu mà dịng bình thƣờng khơng có đƣợc đang là một phƣơng pháp chọn giống rất độc đáo và có hiệu quả bởi những đặc điểm của nó mang lại. Đối tƣợng cây xoan ta tam bội in vitro đã đƣợc chọn tạo thành công và cung cấp bởi phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học thực vật, Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trƣờng Đại học Lâm nghiệp (hình 2.2)[44].
Hình 2.1. Biểu đồ phân tích dịng chảy tế bào của các dịng xoan ta [44]
Cây xoan ta tam bội in vitro đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng nhân nhanh tạo đa chồi MS + 0,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l kinetin + 3% sucrose + 6,8 g aga, pH 5,8, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày, cƣờng độ chiếu sáng 2000 lux, nhiệt độ phịng ni 25 ± 20
C.
Hình 2.2. Cây xoan ta tam bội in vitro 2.1.2. Vật liệu di truyền 2.1.2. Vật liệu di truyền
Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang vector chuyển gen
pBI121/GS1 đƣợc phịng thí nghiệm công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam cung cấp. Vector pBI121 mang gen chuyển GS1 có kích thƣớc khoảng 13 kb và gen chỉ thị chọn lọc nptII
(neomycine phospho transferase gene) đƣợc điều khiển bởi NOS promoter, do đó, chỉ có những thể biến nạp gen mới sống đƣợc trên mơi trƣờng có bổ sung thêm kháng sinh kanamycin.
Hình 2.3. Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121/GS1 2.1.3. Địa điểm nghiên cứu 2.1.3. Địa điểm nghiên cứu
Phịng thí nghiệm Công nghệ sinh học thực vật, Phịng thí nghiệm Cơng nghệ gen và Di truyền phân tử, Vƣờn ƣơm cây giống, Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trƣờng Đại học Lâm nghiệp.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu ảnh hƣởng của tổ hợp NAA và BAP đến khả năng tạo mô sẹo và xác định mơi trƣờng thích hợp cho tạo mơ sẹo;
- Nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ kháng sinh kanamycin đến khả năng chọn lọc và xác định nồng độ kháng sinh thích hợp cho chọn lọc;
- Nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ kháng sinh kanamycin đến khả năng ra rễ của chồi xoan ta tam bội chuyển gen.
- Xác định cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR, kỹ thuật Southern blot và phƣơng pháp điện di gel agarose.
- Đánh giá sinh trƣởng của các dòng cây chuyển gen ở giai đoạn vƣờn ƣơm và nhà lƣới.
+ Đánh giá sinh trƣởng về chiều cao của các dòng cây chuyển gen; + Đánh giá sinh trƣởng về đƣờng kính của các dịng cây chuyển gen.
2.3.1. Ni cấy tạo mô sẹo xoan ta tam bội
Cây xoan ta tam bội in vitro đƣợc sử dụng làm nguyên liệu cho thí nghiệm
nhƣ sau: Thân cây xoan ta tam bội in vitro đƣợc cắt thành từng đoạn ngắn, có chiều dài từ 0,5 - 1 cm. Sau đó các đoạn thân in vitro đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng MS + 20g/l sucrose + 6 g/l aga, bổ sung thêm NAA và BAP ở các nồng độ khác nhau để đánh giá khả năng tạo mơ sẹo. Thí nghiệm đƣợc bố trí trên các cơng thức thí nghiệm:
CT1: MS + 1 mg/l BAP CT2: MS + 1 mg/l BAP + 1 mg/l NAA CT3: MS + 1 mg/l BAP + 1,5 mg/l NAA CT4: MS + 1 mg/l BAP + 2 mg/l NAA CT5: MS + 1 mg/l BAP + 2,5 mg/l NAA CT6: MS + 1 mg/l BAP + 3 mg/l NAA CT7: MS + 1 mg/l BAP + 3,5 mg/l NAA CT8: MS + 1 mg/l BAP + 4 mg/l NAA
Thí nghiệm đƣợc đặt trong điều kiện ánh sáng yếu (1000 lux), nhiệt độ phịng ni: 25 ± 20
C. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần, 50 mẫu/cơng thức thí nghiệm. Chỉ tiêu đánh giá:
- Tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo = X 100%
- Chất lƣợng mơ sẹo: đánh giá các chỉ tiêu hình dạng, màu sắc, độ xốp,…. Thời gian thu thập: Sau 4 tuần nuôi cấy.
2.3.2. Chuyển gen GS1 vào mô sẹo xoan ta tam bội
Dựa theo quy trình chuyển gen vào cây xoan ta (Melia azedazach L.) đạt hiệu suất cao thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đã đƣợc nghiên cứu hồn chỉnh [12], chúng tơi tiến hành chuyển gen vào mô sẹo xoan ta tam bội theo quy trình dƣới đây.
2.3.2.1. Chuẩn bị vi khuẩn A. tumefaciens cho chuyển gen
Nuôi cấy tạo khuẩn lạc: Chủng vi khuẩn A. tumefaciens LBA4404 chứa
vector chuyển gen pBI121-GS1 đƣợc bảo quản trong glycerol ở - 850C. Ni hoạt hóa khuẩn bằng cách cấy trải lên môi trƣờng LB đặc bổ sung 100 mg/l rifamycin và 50 mg/l kanamycin. Nuôi vi khuẩn ở nhiệt độ 280C trong 48 giờ.
Tạo dịch huyền phù vi khuẩn A. tumefaciens: Chọn một khuẩn lạc cho vào
2ml môi trƣờng LB lỏng bổ sung 100 mg/l rifamycin và 50 mg/l kanamycin. Nuôi lắc 200 vòng/phút, ở nhiệt độ 280C, trong 14 - 16 giờ. Sau đó tiến hành hút 1ml dịch vi khuẩn cho vào 50 ml LB lỏng. Ni lắc 200 vịng/phút, ở nhiệt độ 280C, trong 4
- 5 giờ. Ly tâm vi khuẩn ở nhiệt độ 40C, tốc độ 4000 vịng/phút, trong 10 phút. Loại bỏ dịch nổi và hồ tan cặn vi khuẩn trong mơi trƣờng 1/2 MS, pha lỗng cho tới khi dịch có OD600 đạt ≈ 0,5, sau đó bổ sung 200µM acetosyringone. Dịch huyền phù này có thể dùng biến nạp ngay hoặc giữ ở 4o
C trong 1 - 2 giờ
Bảng 2.1. Thành phần môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn A.tumefaciens
Môi trƣờng Thành phần hóa học
LB đặc 5 g/l Yeast extract + 10 g/l NaCl + 10 g/l Trypton + 15 g/l Bactor agar, pH =7
LB lỏng 5 g/l Yeast extract + 10 g/l NaCl + 10 g/l Tryptone, pH = 7
Môi trƣờng tạo dịch huyền phù
vi khuẩn Mơi trƣờng cơ bản ½ MS khơng đƣờng
2.3.2.2. Chuyển gen và tái sinh chồi chuyển gen
a) Nhiễm khuẩn và đồng nuôi cấy
Đặt mẫu mô sẹo chuẩn bị cho biến nạp vào bình chứa dịch huyền phù vi khuẩn A. tumefaciens và lắc nhẹ trong 30 phút. Sau đó thấm khơ mẫu bằng giấy
thấm vô trùng và chuyển mẫu sang môi trƣờng đồng nuôi cấy: MS + 0,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l kinetin + 3% sucrose + 6,8 g/l agar + 200 µM AS, pH=5,8). Đồng ni cấy ở nhiệt độ 250C, trong buồng tối 48 giờ để vi khuẩn xâm nhiễm và chuyển gen sang tế bào thực vật.
b) Rửa khuẩn và tái sinh chồi chuyển gen
Các mẫu sau khi đồng nuôi cấy đƣợc rửa sạch vi khuẩn bằng dung dịch 500mg/l cefotaxime. Thấm khô mẫu rồi chuyển lên môi trƣờng tái sinh chọn lọc.
2.3.3. Chọn lọc thể nhận gen bằng kháng sinh kanamycin
Đối với quá trình chuyển gen, việc chọn lọc và xác định các cá thể mang gen là việc vô cùng quan trọng. Để công tác chọn lọc hiệu quả cần thiết lập đƣợc một môi trƣờng chọn lọc với ngƣỡng phù hợp để có thể loại bỏ phần lớn các cá thể
khơng mang gen chuyển đồng thời giữ lại đƣợc toàn bộ các cá thể đã đƣợc chuyển gen. Do đó, vector chuyển gen pBI121/GS1 ngoài mang gen chuyển đƣợc điều khiển bởi promoter 35S còn mang thêm gen kháng kháng sinh kanamycin (nptII) dƣới sự điều khiển của NOS-promoter, gen này đƣợc biểu hiện cùng với gen đích nên biểu hiện của gen này đƣợc đánh giá sơ bộ là mang gen đích. Do đó gen kháng kanamycin đƣợc coi là yếu tố chọn lọc cá thể mang gen chuyển. Vì vậy chúng tơi tiến hành xác định ngƣỡng nồng độ của kháng sinh kanamycin để chọn lọc hiệu quả cây xoan ta tam bội chuyển gen.
2.3.3.1. Đánh giá ảnh hưởng của hàm lượng kháng sinh kanamycin đến khả năng sống của mô sẹo
Các mẫu mô sẹo xoan ta tam bội chƣa chuyển gen GS1 đƣợc cấy chuyển lên môi trƣờng tái sinh chọn lọc: MS + 0,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l kinetin + 3% sucrose + 6,8 g/l agar + 300 mg/l cefotaxime, pH=5,8 bổ sung kanamycin với các hàm lƣợng khác nhau (0, 75, 100, 125, 150, 200, 250 mg/l) để xác định nồng độ kháng sinh chọn lọc phù hợp phục vụ cho quá trình chọn lọc mẫu chuyển gen.
Nuôi trong điều kiện: thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày, cƣờng độ chiếu sáng 2000 lux, nhiệt độ phịng ni 25 ± 20C để mẫu tái sinh. Trong ba tuần đầu tiên là lần chọn lọc 1. Các mẫu sống sót đƣợc chuyển sang mơi trƣờng chọn lọc lần 2, lần 3 trong thời gian ba tuần ni cấy tiếp theo. Thí nghiệm đƣợc thực hiện lặp lại ba lần, 150 mẫu nghiên cứu cho một nồng độ thử nghiệm.
2.3.3.2. Chọn lọc thể nhận gen GS1 in vitro
Các mẫu mô sẹo sau đồng nuôi cấy với vi khuẩn mang gen GS1 (CG) và mẫu mô sẹo không chuyển gen đƣợc chọn làm đối chứng (wt) đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng tái sinh chọn lọc tối ƣu từ phƣơng pháp 2.4.3.1 và điều kiện nuôi cấy tƣơng tự nhằm chọn lọc đƣợc các mẫu mang gen GS1.
2.3.3.3. Đánh giá ảnh hưởng của hàm lượng kháng sinh kanamycin đến khả năng ra rễ của chồi xoan ta tam bội chuyển gen
Các chồi xoan ta tam bội không chuyển gen sống sót sau 9 tuần nuôi cấy chọn lọc với kháng sinh kanamycin đƣợc tách ra và nuôi cấy độc lập trên môi
trƣờng nhân nhanh MS + 0,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l kinetin + 3% sucrose + 6,8 g/l agar để tăng số lƣợng chồi. Sau đó, tiến hành chọn lọc ra các chồi có chiều dài lớn hơn 2cm, cắt và nuôi cấy trên môi trƣờng ra rễ chọn lọc (½ MSI* bổ sung 0,5 mg/l IBA + 1,5% sucrose + 6,8 g/l agar, pH=5,8) bổ sung kanmycin với hàm lƣợng khác nhau (0, 25, 50, 75, 100 mg/l), 20 chồi xoan ta tam bội không chuyển gen đƣợc đƣa ra thử nghiệm cho mỗi cơng thức thí nghiệm với 3 lần lặp lại.
Điều kiện ni cấy: ni trong tối 5 ngày đầu sau đó chuyển ra ni dƣới ánh sáng dàn đèn với cƣờng độ chiếu sáng 2000 lux, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày, nhiệt độ phịng ni cấy 25±20C. Sau 3 tuần nuôi cấy thống kê kết quả.
Sau khi tiến hành chọn lọc đƣợc công thức chọn lọc ra rễ tối ƣu, tiến hành áp dụng cho chồi xoan ta tam bội chuyển gen (CG) để chọn lọc đƣợc những dịng xoan ta tam bội có khả năng mang gen chuyển. Đối chứng tƣơng ứng là các chồi xoan ta tam bội không chuyển gen (wt).
2.3.4. Xác định cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR
2.3.4.1. Phương pháp tách chiết DNA hệ gen từ mẫu lá xoan ta tam bội in vitro
Các bƣớc thực hiện:
- Cân 0,2 g mảnh lá, bỏ gân lá, nghiền mẫu trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ cho đến khi thành dạng bột mịn. Chuyển vào ống eppendorf 2ml.
- Bổ sung 300µl EBA, 900µl EBB và 100µl SDS. - Vortex và ủ ở 650C trong 10 phút.
- Đặt ống lên đá và thêm 410µl CH3COOK lạnh. Trộn đều bằng cách đảo ngƣợc ống và đặt vào đá trong 3 phút.
- Ly tâm 13000 rpm trong 15 phút ở 40C.
- Chuyển 1ml dịch nổi sang ống ly tâm 1,5ml. Bổ sung 540µl isopropanol lạnh, ủ trong đá trong 20 phút.
- Ly tâm 12000 rpm trong 10 phút, loại bỏ dịch nổi. Rửa cặn trong 500µl EtOH 70% và để khơ ở nhiệt độ phịng.
- Hịa tan cặn trong 50µl nƣớc deion và điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. - Bảo quản DNA tổng số ở -20oC.
2.3.4.2. PCR với mồi đặc hiệu của gen GS1
Trong nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện PCR nhân các đoạn gen GS1 sử dụng cặp mồi của gen GS1 có 2 điểm bắt cặp đặc hiệu: 1 điểm bắt cặp bổ sung với trình tự của gen GS1, 1 điểm bắt cặp trên trình tự vector. Trình tự các mồi đƣợc thể hiện nhƣ đƣợc trình bày ở bảng 2.2, các thành phần cho phản ứng PCR đƣợc đƣa ra ở bảng 2.3 và theo chu kỳ nhiệt ở hình 2.4. Khi nhân dịng gen GS1 với cặp mồi này thì nếu kiểm tra dƣơng tính với gen GS1 sẽ cho sản phẩm PCR với kích thƣớc lý
thuyết là 528bp.
Bảng 2.2. Trình tự các mồi tham gia phản ứng PCR
Tên mồi Trình tự (5’ - 3’) Độ dài
sản phẩm Fw GS1 ACGAGACAGCAGACATGAATACC 528bp Rv GS1 GTTTTCCCAGTCACGACGTTG Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần phản ứng Thể tích (µl) 1 Nƣớc deion 7 2 2X PCR mastermix 10 3 Fw (10 pmol/ µl) 1 4 Rv (10 pmol/ µl) 1 5 Template DNA (50 ng/µl) 1 Tổng thể tích 20
Hình 2.4. Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR 2.3.5. Xác định cây chuyển gen bằng phƣơng pháp Southern blot 2.3.5. Xác định cây chuyển gen bằng phƣơng pháp Southern blot
2.3.5.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số (lượng lớn) từ thực vật
DNA tổng số đƣợc tách đảm bảo độ tinh sạch cho phản ứng cắt với enzyme giới hạn. Đối với xoan ta tam bội chúng tôi tách chiết DNA bằng phƣơng pháp tách chiết CTAB với đệm chiết có chứa PVP, nhƣ sau:
(1) Tách DNA tổng số:
- Nghiền 1 g lá cây xoan ta, chia vào 5 ống eppendorft 2 ml.
- Bổ sung 750 µl đệm chiết CTAB (100 mM Tris- HCl pH8, 20 mM EDTA, 1,4 M NaCl, 2% CTAB, 1% PVP), ủ 60 phút ở 65oC, lắc đều mỗi 15 phút.
- Bổ sung 750 µl hỗn hợp Chloroform : Isoamylalcohol (24:1), đảo đều, ly tâm 12000 rpm trong 15 phút, thu dịch pha trên.
- Bổ sung isopropanol theo tỉ lệ 1:1, lắc đều, ly tâm 12000 rpm trong 15 phút, thu cặn DNA.
- Rửa cặn 2 lần với EtOH 70%. - Làm khơ DNA.
- Hịa tan DNA trong 50 µl dung dịch TE. (2) Tinh sạch DNA:
- Gom DNA tổng số sau khi tách ở 5 ống vào 1 ống eppendorft.
- Bổ sung 500 µl đệm TESC (100 mM Tris-HCl pH8, 20 mM EDTA, 0,4 M NaCl, 2% CTAB), đảo đều, ly tâm 6000 rpm trong 5 phút, thu cặn.
- Hòa cặn trong 500 µl TES (100mM Tris-HCl pH8, 20 mM EDTA, 1M NaCl).
- Bổ sung 500 µl isopropanol, ly tâm thu cặn DNA. - Rửa cặn DNA bằng EtOH 70%. Làm khơ DNA.
- Hịa cặn DNA trong 40 µl nƣớc deion có RNAse và điện di kiểm tra trên gel agarose 1%.
2.3.5.2. Phương pháp Southern blot
Cắt DNA hệ gen bằng enzym giới hạn: DNA tổng số (20 μg) của mỗi dòng
xoan ta tam bội chuyển gen đƣợc cắt bằng enzyme giới hạn XbaI trong 18 giờ ở
37oC với thành phần phản ứng nhƣ bảng 2.4. Thể tích enzyme cắt khơng vƣợt quá 10% tổng thể tích phản ứng.
ảng 2.4. Thành phần phản ứng cắt NA
Thành phần Thể tích cho phản ứng cắt NA tổng số
Enzyme XbaI (10u/µl) a/10 µl
Buffer (10X ) 20 µl
Mẫu a µg
Nƣớc Vừa đủ 200 µl
Điện di agarose: Các sản phẩm cắt đƣợc phân tách trên gel agarose 0,8% ở
điện thế 40 - 50V trong 14 giờ. Bản gel sau khi điện di đƣợc chụp ảnh, rửa với nƣớc cất, sau đó xử lí với dung dịch HCl 0,25 M trong 10 phút cho đến khi băng bromophenol blue ngả màu vàng và ngâm ngay vào dung dịch chuyển màng (NaOH 0,4M, NaCl 0,6M).
Chuyển màng: DNA đƣợc chuyển lên màng lai trong dung dịch kiềm (0,4M
NaOH). Theo đó, màng lai (membrane) đƣợc cắt vừa với bản gel (gel) và đặt dƣới bản gel, một cột giấy (paper towels) đƣợc đặt phía dƣới nhằm tạo áp lực thẩm thấu trong khi dung dịch chuyển màng (reservoir with transfer buffer) thấm truyền từ trên thông qua các tấm giấy lọc (Whatman 3MM wick) đƣợc cấp từ khay đựng buffer. Chuyển màng ít nhất 3h (với gel mỏng) hoặc qua đêm. Sau khi chuyển màng, màng lai đƣợc rửa với dung dịch SSC 2X và để khơ ở nhiệt độ phịng. sau đó cố định mẫu trên màng ở nhiệt độ 65oC, trong 2 giờ.
Tiền lai và lai: Màng lai đƣợc xử lí với dung dịch tiền lai (6X SSC, 5X