Tên mồi Trình tự (5’ - 3’) Độ dài
sản phẩm Fw GS1 ACGAGACAGCAGACATGAATACC 528bp Rv GS1 GTTTTCCCAGTCACGACGTTG Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần phản ứng Thể tích (µl) 1 Nƣớc deion 7 2 2X PCR mastermix 10 3 Fw (10 pmol/ µl) 1 4 Rv (10 pmol/ µl) 1 5 Template DNA (50 ng/µl) 1 Tổng thể tích 20
Hình 2.4. Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR 2.3.5. Xác định cây chuyển gen bằng phƣơng pháp Southern blot 2.3.5. Xác định cây chuyển gen bằng phƣơng pháp Southern blot
2.3.5.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số (lượng lớn) từ thực vật
DNA tổng số đƣợc tách đảm bảo độ tinh sạch cho phản ứng cắt với enzyme giới hạn. Đối với xoan ta tam bội chúng tôi tách chiết DNA bằng phƣơng pháp tách chiết CTAB với đệm chiết có chứa PVP, nhƣ sau:
(1) Tách DNA tổng số:
- Nghiền 1 g lá cây xoan ta, chia vào 5 ống eppendorft 2 ml.
- Bổ sung 750 µl đệm chiết CTAB (100 mM Tris- HCl pH8, 20 mM EDTA, 1,4 M NaCl, 2% CTAB, 1% PVP), ủ 60 phút ở 65oC, lắc đều mỗi 15 phút.
- Bổ sung 750 µl hỗn hợp Chloroform : Isoamylalcohol (24:1), đảo đều, ly tâm 12000 rpm trong 15 phút, thu dịch pha trên.
- Bổ sung isopropanol theo tỉ lệ 1:1, lắc đều, ly tâm 12000 rpm trong 15 phút, thu cặn DNA.
- Rửa cặn 2 lần với EtOH 70%. - Làm khơ DNA.
- Hịa tan DNA trong 50 µl dung dịch TE. (2) Tinh sạch DNA:
- Gom DNA tổng số sau khi tách ở 5 ống vào 1 ống eppendorft.
- Bổ sung 500 µl đệm TESC (100 mM Tris-HCl pH8, 20 mM EDTA, 0,4 M NaCl, 2% CTAB), đảo đều, ly tâm 6000 rpm trong 5 phút, thu cặn.
- Hòa cặn trong 500 µl TES (100mM Tris-HCl pH8, 20 mM EDTA, 1M NaCl).
- Bổ sung 500 µl isopropanol, ly tâm thu cặn DNA. - Rửa cặn DNA bằng EtOH 70%. Làm khơ DNA.
- Hịa cặn DNA trong 40 µl nƣớc deion có RNAse và điện di kiểm tra trên gel agarose 1%.
2.3.5.2. Phương pháp Southern blot
Cắt DNA hệ gen bằng enzym giới hạn: DNA tổng số (20 μg) của mỗi dòng
xoan ta tam bội chuyển gen đƣợc cắt bằng enzyme giới hạn XbaI trong 18 giờ ở
37oC với thành phần phản ứng nhƣ bảng 2.4. Thể tích enzyme cắt khơng vƣợt quá 10% tổng thể tích phản ứng.
ảng 2.4. Thành phần phản ứng cắt NA
Thành phần Thể tích cho phản ứng cắt NA tổng số
Enzyme XbaI (10u/µl) a/10 µl
Buffer (10X ) 20 µl
Mẫu a µg
Nƣớc Vừa đủ 200 µl
Điện di agarose: Các sản phẩm cắt đƣợc phân tách trên gel agarose 0,8% ở
điện thế 40 - 50V trong 14 giờ. Bản gel sau khi điện di đƣợc chụp ảnh, rửa với nƣớc cất, sau đó xử lí với dung dịch HCl 0,25 M trong 10 phút cho đến khi băng bromophenol blue ngả màu vàng và ngâm ngay vào dung dịch chuyển màng (NaOH 0,4M, NaCl 0,6M).
Chuyển màng: DNA đƣợc chuyển lên màng lai trong dung dịch kiềm (0,4M
NaOH). Theo đó, màng lai (membrane) đƣợc cắt vừa với bản gel (gel) và đặt dƣới bản gel, một cột giấy (paper towels) đƣợc đặt phía dƣới nhằm tạo áp lực thẩm thấu trong khi dung dịch chuyển màng (reservoir with transfer buffer) thấm truyền từ trên thông qua các tấm giấy lọc (Whatman 3MM wick) đƣợc cấp từ khay đựng buffer. Chuyển màng ít nhất 3h (với gel mỏng) hoặc qua đêm. Sau khi chuyển màng, màng lai đƣợc rửa với dung dịch SSC 2X và để khơ ở nhiệt độ phịng. sau đó cố định mẫu trên màng ở nhiệt độ 65oC, trong 2 giờ.
Tiền lai và lai: Màng lai đƣợc xử lí với dung dịch tiền lai (6X SSC, 5X
Denhardt’s solution, 0,5% SDS, 50% (v/v) deionized formamide, 50 µg/ml DNA tinh trùng cá hồi đã biến tính) (200 µl/cm2) ở 44ºC trong 4h. Sau đó, màng lai đƣợc lai với dung dịch lai chứa mẫu dò gen GS1 gắn Biotin (100 ng/ml) ở 42ºC qua đêm. Mẫu dò gắn biotin đƣợc tổng hợp dựa vào sản phẩm PCR của gen GS1 đƣợc nhân từ vector tách dòng theo hƣớng dẫn của bộ kit Biotin DecaLabel DNA Labeling Kit (Thermo Scientific).
Rửa màng: Màng đƣợc rửa 2 lần với đệm rửa 2X (SSC 2X bổ sung SDS
1%) ở nhiệt độ phòng, 1 lần với đệm rửa 1X ở 65oC – 15 phút, 2 lần với đệm rửa 0,1X ở 65o
C – 15 phút.
Hiện màng: Phức hợp enzyme Streptavidin-AP có khả năng bám gắn đặc
hiệu với gốc biotin trên mẫu dị (hình 2.3). Ngồi ra, enzyme Alkaline phosphatase có khả năng phân hủy BCIP-T (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphatase, p- toluidine salt) thành hợp chất có màu tím đen. Nhờ vậy có thể phát hiện mẫu dị gắn với doạn DNA cần nghiên cứu trên màng lai. Quy trình này đƣợc thực hiện theo hƣớng dẫn của bộ kit Biotin Chromogenic Detection Kit (Themoscience).
2.3.5. Phƣơng pháp đánh giá sinh trƣởng của các dòng xoan ta tam bội chuyển gen gen
2.3.5.1. Huấn luyện và trồng cây con trong điều kiện nhà lưới
Trong giai đoạn huấn luyện cây con in vitro, khi đƣa cây mô từ điều kiện
phịng thí nghiệm ra nhà lƣới cây con phải trải qua các giai đoạn thích nghi dần dần với điều kiện ánh sáng, nhiệt độ ngồi mơi trƣờng tự nhiên. Để nghiên cứu ảnh hƣởng của các loại giá thể tới cây mô đƣa ra vƣờn ƣơm, chúng tôi nghiên cứu phối trộn thành phần giá thể theo 4 công thức sau: GT1 (90% đất đồi + 10% trấu hun), GT2 (20% đất đồi + 80% mùn hữu cơ), GT3 (70% đất đồi + 30% trấu hun), GT4 (70% đất đồi + 20% mùn hữu cơ + 10% trấu hun). Từ đó đánh giá sức sống của cây xoan ta tam bội trong các mơi trƣờng giá thể khác nhau.
Thí nghiệm đƣợc bố trí với 3 lần lặp lại, mỗi lần là 30 cây cho một công thức giá thể. Cây trồng đƣợc chăm sóc nhƣ sau: tƣới nƣớc mỗi ngày 2 lần vào buổi sáng
và chiều tối với lƣợng nƣớc tƣới trung bình 4 lit/m2 trong 3 tháng đầu (Đoàn Thị Hoa, 2017).
2.3.5.2. Đánh giá các chỉ tiêu sinh lý của cây chuyển gen
Các dòng xoan ta tam bội chuyển gen GS1 đã đƣợc kiểm tra dƣơng tính với
phản ứng PCR, lai Southern và dòng đối chứng đƣợc lựa chọn để đánh giá khả năng sinh trƣởng trong điều kiện nhà lƣới. Các dòng này đƣợc nhân nhanh, ra rễ in vitro trên môi trƣờng bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin và đã tạo thành cây hoàn chỉnh. Sau khi chọn đƣợc công thức giá thể tối ƣu từ phƣơng pháp 2.3.5.1, tiến hành trồng các dòng xoan chuyển gen GS1 trong điều kiện nhà lƣới ba tháng giúp cây
thích nghi với mơi trƣờng bên ngoài. Từ tháng thứ tƣ các cây xoan ta tam bội chuyển gen sống của mỗi dòng đƣợc chuyển ra trồng trong khu vực có điều kiện cách ly vật lý bằng rào chắn và trồng keo (hoặc loài cây khác) xung quanh tạo vùng đệm cách ly cây xoan ta chuyển gen với môi trƣờng xung quanh (hình 2.5). Các chỉ tiêu đánh giá sinh trƣởng của các dòng chuyển gen và dịng đối chứng khơng chuyển gen ở các giai đoạn phát triển khác nhau đƣợc tiến hành nhƣ sau:
Đánh giá khả năng sinh trƣởng về chiều cao: Đo chiều cao vút ngọn (Hvn) của các dòng xoan ta chuyển gen và đối chứng tính từ gốc cho đến đỉnh sinh trƣởng. Đánh giá khả năng sinh trƣởng về đƣờng kính: Đo đƣờng kính gốc (D00) và
đƣờng kính ngang ngực (D1,3).
Các số liệu đƣợc thu thập, tính tốn và xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel. Quá trình xử lý số liệu đƣợc thực hiện trên máy tính với ứng dụng Data Analysis của chƣơng trình Excel 5.0. Dùng hàm thống kê Anova để phân tích phƣơng sai một nhân tố với ba lần lặp lại.
Tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo = X 100%
Tỉ lệ mẫu sống = X 100%
Tỉ lệ tái sinh = X 100%
Tỉ lệ chồi ra rễ = X 100%
Hiệu suất chuyển gen = X 100%
Các số liệu về chỉ tiêu đánh giá sinh trƣởng D00, D1.3, Hvn của các dòng xoan ta tam bội đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp điều tra Lâm học thông thƣờng (Giáo trình Điều tra rừng - Vũ Tiến Hinh, Phạm Ngọc Giao, 1997) và theo quy phạm xây dựng rừng giống và vƣờn giống QPN 15-93.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nghiên cứu ảnh hƣởng của tổ hợp NAA và AP đến khả năng tạo mô sẹo xoan ta tam bội
Để đánh giá ảnh hƣởng của NAA và BAP lên khả năng tạo mô sẹo của xoan ta tam bội, chúng tôi sử dụng các đoạn thân cấy lên môi trƣờng bổ sung theo dải nồng độ NAA và BAP đƣợc mô tả ở phƣơng pháp 2.3.1. Sau bốn tuần ở tất cả tám cơng thức thí nghiệm đều thu đƣợc mơ sẹo cịn ở cơng thức đối chứng khơng có sự tạo thành mơ sẹo (hình 3.1). Đồng thời, quan sát các mơ sẹo tạo thành, nhận thấy có bốn loại khác nhau về độ cứng và màu sắc: Mô sẹo loại 1: Chỉ sùi sẹo cứng ở cả hai đầu đoạn thân; mô sẹo loại 2: Sùi sẹo thành khối, cứng, màu trắng xanh hoặc hồng; mô sẹo loại 3: Sùi sẹo thành khối, xốp, màu nâu hoặc hồng; và mô sẹo loại 4: xốp, to, mọng nƣớc, màu trắng hoặc hơi ngả vàng [11].
Kết quả cụ thể đƣợc thống kê tại bảng 3.1 nhƣ sau:
Bảng 3.1 Ảnh hƣởng của chất điều hịa sinh trƣởng đến khả năng tạo mơ sẹo
CTTN Chất ĐHST (mg/l) Số mẫu cấy Số mẫu tạo mô sẹo Tỉ lệ tạo mô sẹo (%) Loại mô sẹo BAP NAA ĐC 0 0 150 0 0±0 - CT1 1 0 150 104 69,3±1,3 1, 2 CT2 1 1 150 83 55,3±1,3 1, 3, 4 CT3 1 1,5 150 94 62,7±1,3 1, 3 CT4 1 2 150 103 68,7±5,3 1, 3, 4 CT5 1 2,5 150 113 77,3±1,3 3, 4 CT6 1 3 150 131 87,3±1,3 1, 2 CT7 1 3,5 150 114 76±4,0 2, 3 CT8 1 4 150 107 71,3±5,3 1, 3, 4
Kết quả từ bảng 3.1 cho thấy bổ sung tổ hợp chất điều hịa sinh trƣởng BAP và NAA vào mơi trƣờng ni cấy kích thích khả năng tạo mơ sẹo khá tốt, cả tám công thức đều cho tỉ lệ tạo mô sẹo khác biệt và cao hơn đối chứng, sự khác nhau này có ý nghĩ thống kê với F (812,5313) lớn hơn F crit (2,510158). Khi chỉ bổ sung BAP (CT1) thì tỉ lệ tạo mơ sẹo đạt 69,3% nhƣng mô sẹo tạo thành không đều chủ yếu là mô sẹo loại 1. Khi bổ sung phối kết hợp cả BAP và NAA thì tỉ lệ tạo mơ sẹo tăng lên từ công thức 2 đến công thức 6 (55,3 – 87,3%) và giảm dần từ công thức 6 đến công thức 8 (87,3 - 71,3%). Nhƣ vậy về tỉ lệ tạo mơ sẹo thì cơng thức 6 cho kết quả cao nhất là 87,3%, tiếp đến là công thức 7 tỉ lệ tạo mô sẹo cũng khá cao 76%. Tuy nhiên chất lƣợng mô sẹo tạo ra ở hai cơng thức này lại có sự khác biệt, trong khi công thức 7 chủ yếu tạo thành mơ sẹo loại 3, số ít là loại 2 thì cơng thức 6 chủ
yếu là mô sẹo loại 2 và loại 1. Theo nghiên cứu của Bùi Phƣơng Thảo năm 2007, chỉ mơ sẹo loại 1,2 có khả năng phát sinh chồi, mơ sẹo loại 3 có khả năng tạo phơi cịn mơ sẹo loại 4 hầu nhƣ khơng có sự phát sinh hình thái, mơ sẹo thƣờng thâm đen rồi chết. Từ đó chọn đƣợc cơng thức 6 là cơng thức tạo mô sẹo tối ƣu nhất, phục vụ cho nghiên cứu chuyển gen đạt hiệu quả cao. Kết quả thu đƣợc cũng tƣơng tự với nghiên cứu của Sharry năm 2006 [40].
Các công thức trong nghiên cứu này tạo ra mơ sẹo có tỉ lệ tƣơng đối cao (87,3%) tạo từ thân sinh dƣỡng invitro, so với các nghiên cứu trƣớc đây về tạo mô sẹo xoan ta (92,2%) tạo từ thân mầm phơi hạt [5] thì kết quả thấp hơn, nhƣng trong nghiên cứu này vật liệu sử dụng để tạo mô sẹo là thân cây xoan ta nuôi cấy in vitro nên khả năng tạo mô sẹo sẽ thấp hơn sử dụng vật liệu tạo mơ sẹo là thân mầm có nguồn gốc tạo từ phôi hạt của các nghiên cứu về xoan ta trƣớc đó. Điều này chỉ ra rằng việc tạo mô sẹo từ vật liệu thân in vitro là tƣơng đối khó, cần tối ƣu nhiều điều kiện nhƣ phối kết hợp chất điều hòa sinh trƣởng, điều kiện vật lý,... để đạt đƣợc kết quả tốt.
Qua 6 lần tạo mô sẹo phục vụ cho chuyển gen áp dụng công thức tạo mô sẹo đƣợc tối ƣu (CT6) nhƣ sau MS + 1 mg/l BAP + 3 mg/l NAA + 20g/l sucrose + 6 g/l aga. Kết quả thu đƣợc thể hiện trong bảng 3.2 cho thấy tỉ lệ tạo mơ sẹo trung bình đạt 87% qua sáu lần thí nghiệm.
Bảng 3.2. Kết quả tạo mơ sẹo xoan ta tam bội
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Lần 6 Số mẫu thí nghiệm 425 434 426 747 778 756 Số mô sẹo tạo thành 371 378 375 651 678 662 Tỉ lệ tạo mô sẹo (%) 87,29 87,09 88,03 87,15 87,15 87,57
3.2. Chọn lọc thể nhận gen bằng kháng sinh kanamycin
Các mô sẹo sau khi đƣợc chuyển gen đƣợc tái sinh chồi trên môi trƣờng chọn lọc. Các chồi này chƣa hẳn là chồi mang gen cần chuyển do nồng độ chọn lọc chỉ tƣơng đối. Một số chồi có sức sinh trƣởng đặc biệt mạnh, các chồi khơng mang gen vẫn có khả năng sống sót. Ngồi ra do kanamycin trong mơi trƣờng chọn lọc có thời gian sử dụng kéo dài làm mất tác dụng chọn lọc dẫn đến chọn lọc không hiệu quả. Do đó, việc tiến hành chọn lọc các chồi chuyển gen trên môi trƣờng tái sinh nhiều lần là cần thiết để loại bỏ chồi có khả năng không mang gen. Các chồi cịn sống sót trên môi trƣờng chọn lọc nhiều lần có khả năng mang gen mục tiêu cao. Bùi Văn Thắng năm 2013 đã nghiên cứu thành công nồng độ kanamycin cho chọn lọc chồi chuyển gen từ mẫu thân mầm là 150 mg/l và nồng độ chọn lọc cho môi trƣờng ra rễ là 50 mg/l. Tuy nhiên mỗi vật liệu chuyển gen có khả năng đáp ứng với lƣợng kanamycin khác nhau. Nghiên cứu này sử dụng vật liệu chuyển gen là mơ sẹo do đó cần xác định lại nồng độ của kanamycin cho chọn lọc chồi chuyển gen
3.2.1. Đánh giá ảnh hƣởng của hàm lƣợng kháng sinh kanamycin đến khả năng sống của mô sẹo năng sống của mô sẹo
Kết quả từ bảng 3.3 và biểu đồ 3.1 cho thấy kanamycin ảnh hƣởng trực tiếp tới khả năng sống của mô sẹo. Tỉ lệ sống sót của chồi xoan ta tam bội tái sinh giảm mạnh từ 76,6% (75 mg/l kanamycin) xuống còn 2% (150 mg/l kanamycin). Ở nồng độc cao hơn (200 mg/l kanmycin) toàn bộ mẫu đều chết. Khi tăng nồng độ kanamycin lên 250 mg/l, khơng cịn mẫu nào sống trên môi trƣờng này kể từ lần chọn lọc thứ hai. Theo Brukhin và cs (2000), ngƣỡng nồng độ chất chọn lọc phù hợp khi loại bỏ đƣợc khoảng 90% các cây không chuyển gen. Căn cứ vào các kết quả trên, chúng tôi lựa chọn nồng độ kanamycin là 150mg/l (CT4) làm cơ sở để chọn lọc các cây xoan ta tam bội chuyển gen ở các thí nghiệm tiếp theo. Kết quả mơ sẹo chƣa chuyển gen sau 3 lần chọn lọc đƣợc tính tốn với hàm ANOVA một nhân tố cho kết quả F>F crit, điều này chứng tỏ sự sai khác giữa các lần thí nghiệm và các cơng thức thí nghiệm là có ý ngĩa thống kê.
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của nồng độ kanamycin đến khả năng sống của mô sẹo CTTN Kanamycin CTTN Kanamycin (mg/l) Số mẫu Tỉ lệ mẫu sống lần 1 (%) Tỉ lệ mẫu sống lần 2 (%) Tỉ lệ mẫu sống lần 3 (%) ĐC 0 150 100±0 100±0 100±0 CT1 75 150 94,67±5,3 83,33±9,3 76,67±5,3 CT2 100 150 86±4 70±4 53,33±1,3 CT3 125 150 80±4 60,67±9,3 27,33±9,3 CT4 150 150 68,67±1,3 20,67±9,3 2±4 CT5 200 150 46±16 13,33±1,3 0±0 CT6 250 150 1,33±5,3 0±0 0±0
Biểu đồ 3.1. Ảnh hƣởng của nồng độ kanamycin đến khả năng sống của mô sẹo
0 20 40 60 80 100 120 ĐC CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 CT6 Lần 1 Lần 2 Lần 3 (%)
Các thí nghiệm trƣớc đã chọn đƣợc nồng độ kanamycin phù hợp cho sàng lọc thể nhận gen là 150 mg/l (CT4) và tiến hành thí nghiệm chuyển gen GS1 vào mô
sẹo xoan ta tam bội theo phƣơng pháp 2.3.3. Trên môi trƣờng này chỉ các tế bào chứa cấu trúc gen nptII mã hóa enzyme neomycin phosphotranferase có khả năng
phân giải kháng sinh kanamycin mới giúp tế bào sống sót và tái sinh chồi. Kết quả các chồi thu đƣợc trên môi trƣờng tái sinh có tiềm năng là các chồi chuyển gen. Kết quả nghiên cứu chuyển gen GS1 qua 3 lần chọn lọc đƣợc thể hiện ở bảng 3.4. Qua 3 đợt thí nghiệm tổng cộng có 990 mơ sẹo đồng ni cấy với vi khuẩn A. tumefaciens