A. Mô sẹo chết, B, C, D mô sẹo tái sinh qua chọn lọc lần 1, 2, 3
Biểu đồ 3.2. Hiệu quả chọn lọc mô sẹo chuyển gen GS1
Hiệu suất chọn lọc qua mỗi lần chọn lọc đƣợc thể hiện trên biểu đồ 3.2. Nhƣ vậy qua ba lần chọn lọc, hiệu suất chọn lọc thu đƣợc là 5,959%. Hiệu suất trong
80,897 38,081 5,959 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Hiệu suất chọn lọc (%)
nghiên cứu này cao hơn so với các nghiên cứu trƣớc đây về xoan ta chuyển gen bằng thân mầm (5,73%) [6]. Điều này có thể giải thích rằng mơ sẹo chuyển gen có độ trẻ hóa cao hơn so với các vật liệu khác nên có thể tiếp nhận các khuẩn mang gen chuyển tốt hơn.
3.3. Đánh giá ảnh hƣởng của hàm lƣợng kháng sinh kanamycin đến khả năng ra rễ của chồi xoan ta tam bội chuyển gen ra rễ của chồi xoan ta tam bội chuyển gen
Các chồi sau ba lần chọn lọc sống đƣợc trên môi trƣờng tái sinh chồi có chứa chất chọn lọc 150 mg/l kanamycin và có chiều cao 2 - 2,5 cm đƣợc tách thành từng chồi đơn lẻ và cấy chuyển sang môi trƣờng ra rễ (½ MSI* + 0,5mg/l IBA + 0,2 mg/l IBA, có bổ sung thêm kanamycin để đánh giá khả năng ra rễ.
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của kanamycin đến khả năng ra rễ của chồi xoan ta tam bội không chuyển gen
Nồng độ Kanamycin (mg/l) Số chồi thí nghiệm Số chồi ra rễ Tỉ lệ chồi ra rễ (%) 0 60 59 98,3 25 60 48 80 50 60 29 48,3 75 60 3 5 100 60 0 0
Kết quả thu đƣợc ở bảng 3.5 cho thấy kanamycin có ảnh hƣởng đến quá trình ra rễ của các chồi xoan ta tam bội không chuyển gen, điều này là phù hợp theo báo cáo của tác giả Bùi Văn Thắng [12]. Đồng thời khác biệt giữa các cơng thức thí nghiệm này đƣợc chứng minh là có ý nghĩa thống kê (F>F crit). Ở các nồng độ kanamycin là 0; 25; 50 mg/l thì các chồi xoan ta tam bội khơng chuyển gen vẫn có khả năng ra rễ với tỉ lệ trung bình là 98,3 - 48,3%. Khi tăng nồng độ kanamycin lên
năng ra rễ, tỉ lệ chồi ra rễ đạt 5% và nồng độ kanamycin đạt 100 mg/l thì các chồi này hồn tồn khơng có khả năng ra rễ. Hình ảnh miêu tả cụ thể đƣợc thể hiện ở hình 3.3. Từ kết quả này cho thấy sử dụng kanamycin ở nồng độ 75 mg/l để chọn lọc ra rễ xoan ta tam bội chuyển gen là thích hợp.
Hình 3.3. Ảnh hƣởng của kanamycin đến khả năng ra rễ của chồi xoan ta tam bội không chuyển gen
A. Chồi xoan ta tam bội trên môi trƣờng nhân nhanh, B-F. Chồi xoan ta tam bội trên môi trƣờng ra rễ bổ sung kanamycin nồng độ lần lƣợt 0, 25, 50, 75, 100 mg/l
Kết quả nghiên cứu trƣớc đó đã đƣa ra đƣợc nồng độ kanamycin phù hợp cho chọn lọc ra rễ chồi xoan ta tam bội chuyển gen là 75 mg/l. Từ đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đánh giá chọn lọc các chồi xoan ta tam bội mang gen GS1, kết quả qua ba đợt nghiên cứu thu đƣợc nhƣ ở bảng 3.6. Theo đó, các mẫu đối chứng khơng chuyển gen (wt) có tổng 6 chồi ra rễ trên tổng số 139 chồi thí nghiệm, nhƣ vậy tỉ lệ ra rễ chỉ đạt 4,21%. Song song với đó là các chồi chuyển gen, trên mơi trƣờng ra rễ chọn lọc đã thu đƣợc 45 chồi chuyển gen ra rễ tạo cây hồn chỉnh, tỉ lệ ra rễ trung
bình chiếm 32,93%. 45 chồi ra rễ hoàn chỉnh này đƣợc đánh số dòng từ G1-G45, huấn luyện và chuyển ra trồng chăm sóc trong nhà lƣới để phục vụ phân tích sự có mặt của gen chuyển bằng phƣơng pháp sinh học phân tử.
Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của kanamycin đến khả năng ra rễ của chồi xoan ta tam bội chuyển gen
Đợt thí nghiệm Mẫu thí nghiệm Số chồi thí nghiệm Số chồi ra rễ Tỉ lệ chồi ra rễ (%) Đợt 1 wt 46 2 4,35 CG 46 18 39,13 Đợt 2 wt 51 3 5,88 CG 51 11 21,57 Đợt 3 wt 42 1 2,38 CG 42 16 38,10
Hình 3.4. Ảnh hƣởng của kanamycin đến khả năng ra rễ của chồi xoan ta tam bội chuyển gen
3.4. Kiểm tra sự có mặt của gen GS1 trong các dòng xoan ta tam bội chuyển
gen GS1
Để kiểm tra sự có mặt của gen GS1 trong các dòng cây đã vƣợt qua giai đoạn sàng lọc trên môi trƣờng ra rễ bổ sung kháng sinh chọn lọc thì tiến hành thu mẫu lá của của tất cả 45 cây xoan ta tam bội chuyển gen và cây xoan ta tam bội không chuyển gen là đối chứng để tách chiết DNA tổng số. Kết quả thể hiện ở hình 3.5 và phụ lục bảng B.1
Kết quả tách chiết DNA cho thấy DNA tổng số thu đƣợc với hàm lƣợng tƣơng đối lớn, ít bị đứt gãy và đảm bảo đủ yêu cầu để tiến hành phản ứng PCR.
Hình 3.5: Kết quả điện di DNA tổng số của các dòng cây trên gel agarose 1%
WT. DNA tổng số của cây đối chứng không chuyển gen, 1-45. DNA tổng số của các dòng xoan ta tam bội chuyển gen G1-G45
Để kiểm tra sự có mặt của gen GS1 trong các dòng xoan ta chuyển gen,
chúng tôi thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho đoạn gen GS1 trong vector pBI121. Chu trình nhiệt và trình tự các cặp mồi sử dụng nhƣ đã miêu tả ở mục 2.3.4.2. Kết quả PCR đƣợc kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 1% và đƣợc chụp lại bằng máy chụp ảnh gel, thu đƣợc nhƣ sau: