CHƢƠNG 2 : ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.5.2. Đánh giá các chỉ tiêu sinh lý của cây chuyển gen
Các dòng xoan ta tam bội chuyển gen GS1 đã đƣợc kiểm tra dƣơng tính với
phản ứng PCR, lai Southern và dòng đối chứng đƣợc lựa chọn để đánh giá khả năng sinh trƣởng trong điều kiện nhà lƣới. Các dòng này đƣợc nhân nhanh, ra rễ in vitro trên môi trƣờng bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin và đã tạo thành cây hoàn chỉnh. Sau khi chọn đƣợc công thức giá thể tối ƣu từ phƣơng pháp 2.3.5.1, tiến hành trồng các dòng xoan chuyển gen GS1 trong điều kiện nhà lƣới ba tháng giúp cây
thích nghi với mơi trƣờng bên ngoài. Từ tháng thứ tƣ các cây xoan ta tam bội chuyển gen sống của mỗi dòng đƣợc chuyển ra trồng trong khu vực có điều kiện cách ly vật lý bằng rào chắn và trồng keo (hoặc loài cây khác) xung quanh tạo vùng đệm cách ly cây xoan ta chuyển gen với mơi trƣờng xung quanh (hình 2.5). Các chỉ tiêu đánh giá sinh trƣởng của các dòng chuyển gen và dịng đối chứng khơng chuyển gen ở các giai đoạn phát triển khác nhau đƣợc tiến hành nhƣ sau:
Đánh giá khả năng sinh trƣởng về chiều cao: Đo chiều cao vút ngọn (Hvn) của các dòng xoan ta chuyển gen và đối chứng tính từ gốc cho đến đỉnh sinh trƣởng. Đánh giá khả năng sinh trƣởng về đƣờng kính: Đo đƣờng kính gốc (D00) và
đƣờng kính ngang ngực (D1,3).
Các số liệu đƣợc thu thập, tính tốn và xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel. Quá trình xử lý số liệu đƣợc thực hiện trên máy tính với ứng dụng Data Analysis của chƣơng trình Excel 5.0. Dùng hàm thống kê Anova để phân tích phƣơng sai một nhân tố với ba lần lặp lại.
Tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo = X 100%
Tỉ lệ mẫu sống = X 100%
Tỉ lệ tái sinh = X 100%
Tỉ lệ chồi ra rễ = X 100%
Hiệu suất chuyển gen = X 100%
Các số liệu về chỉ tiêu đánh giá sinh trƣởng D00, D1.3, Hvn của các dòng xoan ta tam bội đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp điều tra Lâm học thông thƣờng (Giáo trình Điều tra rừng - Vũ Tiến Hinh, Phạm Ngọc Giao, 1997) và theo quy phạm xây dựng rừng giống và vƣờn giống QPN 15-93.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nghiên cứu ảnh hƣởng của tổ hợp NAA và AP đến khả năng tạo mô sẹo xoan ta tam bội
Để đánh giá ảnh hƣởng của NAA và BAP lên khả năng tạo mô sẹo của xoan ta tam bội, chúng tôi sử dụng các đoạn thân cấy lên môi trƣờng bổ sung theo dải nồng độ NAA và BAP đƣợc mô tả ở phƣơng pháp 2.3.1. Sau bốn tuần ở tất cả tám cơng thức thí nghiệm đều thu đƣợc mơ sẹo cịn ở cơng thức đối chứng khơng có sự tạo thành mơ sẹo (hình 3.1). Đồng thời, quan sát các mơ sẹo tạo thành, nhận thấy có bốn loại khác nhau về độ cứng và màu sắc: Mô sẹo loại 1: Chỉ sùi sẹo cứng ở cả hai đầu đoạn thân; mô sẹo loại 2: Sùi sẹo thành khối, cứng, màu trắng xanh hoặc hồng; mô sẹo loại 3: Sùi sẹo thành khối, xốp, màu nâu hoặc hồng; và mô sẹo loại 4: xốp, to, mọng nƣớc, màu trắng hoặc hơi ngả vàng [11].
Kết quả cụ thể đƣợc thống kê tại bảng 3.1 nhƣ sau:
Bảng 3.1 Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng đến khả năng tạo mô sẹo
CTTN Chất ĐHST (mg/l) Số mẫu cấy Số mẫu tạo mô sẹo Tỉ lệ tạo mô sẹo (%) Loại mô sẹo BAP NAA ĐC 0 0 150 0 0±0 - CT1 1 0 150 104 69,3±1,3 1, 2 CT2 1 1 150 83 55,3±1,3 1, 3, 4 CT3 1 1,5 150 94 62,7±1,3 1, 3 CT4 1 2 150 103 68,7±5,3 1, 3, 4 CT5 1 2,5 150 113 77,3±1,3 3, 4 CT6 1 3 150 131 87,3±1,3 1, 2 CT7 1 3,5 150 114 76±4,0 2, 3 CT8 1 4 150 107 71,3±5,3 1, 3, 4
Kết quả từ bảng 3.1 cho thấy bổ sung tổ hợp chất điều hòa sinh trƣởng BAP và NAA vào mơi trƣờng ni cấy kích thích khả năng tạo mơ sẹo khá tốt, cả tám công thức đều cho tỉ lệ tạo mô sẹo khác biệt và cao hơn đối chứng, sự khác nhau này có ý nghĩ thống kê với F (812,5313) lớn hơn F crit (2,510158). Khi chỉ bổ sung BAP (CT1) thì tỉ lệ tạo mô sẹo đạt 69,3% nhƣng mô sẹo tạo thành không đều chủ yếu là mô sẹo loại 1. Khi bổ sung phối kết hợp cả BAP và NAA thì tỉ lệ tạo mơ sẹo tăng lên từ công thức 2 đến công thức 6 (55,3 – 87,3%) và giảm dần từ công thức 6 đến công thức 8 (87,3 - 71,3%). Nhƣ vậy về tỉ lệ tạo mơ sẹo thì cơng thức 6 cho kết quả cao nhất là 87,3%, tiếp đến là công thức 7 tỉ lệ tạo mô sẹo cũng khá cao 76%. Tuy nhiên chất lƣợng mô sẹo tạo ra ở hai cơng thức này lại có sự khác biệt, trong khi cơng thức 7 chủ yếu tạo thành mơ sẹo loại 3, số ít là loại 2 thì cơng thức 6 chủ
yếu là mô sẹo loại 2 và loại 1. Theo nghiên cứu của Bùi Phƣơng Thảo năm 2007, chỉ mô sẹo loại 1,2 có khả năng phát sinh chồi, mơ sẹo loại 3 có khả năng tạo phơi cịn mơ sẹo loại 4 hầu nhƣ khơng có sự phát sinh hình thái, mơ sẹo thƣờng thâm đen rồi chết. Từ đó chọn đƣợc công thức 6 là công thức tạo mô sẹo tối ƣu nhất, phục vụ cho nghiên cứu chuyển gen đạt hiệu quả cao. Kết quả thu đƣợc cũng tƣơng tự với nghiên cứu của Sharry năm 2006 [40].
Các công thức trong nghiên cứu này tạo ra mơ sẹo có tỉ lệ tƣơng đối cao (87,3%) tạo từ thân sinh dƣỡng invitro, so với các nghiên cứu trƣớc đây về tạo mô sẹo xoan ta (92,2%) tạo từ thân mầm phơi hạt [5] thì kết quả thấp hơn, nhƣng trong nghiên cứu này vật liệu sử dụng để tạo mô sẹo là thân cây xoan ta nuôi cấy in vitro nên khả năng tạo mô sẹo sẽ thấp hơn sử dụng vật liệu tạo mơ sẹo là thân mầm có nguồn gốc tạo từ phôi hạt của các nghiên cứu về xoan ta trƣớc đó. Điều này chỉ ra rằng việc tạo mô sẹo từ vật liệu thân in vitro là tƣơng đối khó, cần tối ƣu nhiều điều kiện nhƣ phối kết hợp chất điều hòa sinh trƣởng, điều kiện vật lý,... để đạt đƣợc kết quả tốt.
Qua 6 lần tạo mô sẹo phục vụ cho chuyển gen áp dụng công thức tạo mô sẹo đƣợc tối ƣu (CT6) nhƣ sau MS + 1 mg/l BAP + 3 mg/l NAA + 20g/l sucrose + 6 g/l aga. Kết quả thu đƣợc thể hiện trong bảng 3.2 cho thấy tỉ lệ tạo mơ sẹo trung bình đạt 87% qua sáu lần thí nghiệm.
Bảng 3.2. Kết quả tạo mơ sẹo xoan ta tam bội
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Lần 6 Số mẫu thí nghiệm 425 434 426 747 778 756 Số mô sẹo tạo thành 371 378 375 651 678 662 Tỉ lệ tạo mô sẹo (%) 87,29 87,09 88,03 87,15 87,15 87,57
3.2. Chọn lọc thể nhận gen bằng kháng sinh kanamycin
Các mô sẹo sau khi đƣợc chuyển gen đƣợc tái sinh chồi trên môi trƣờng chọn lọc. Các chồi này chƣa hẳn là chồi mang gen cần chuyển do nồng độ chọn lọc chỉ tƣơng đối. Một số chồi có sức sinh trƣởng đặc biệt mạnh, các chồi khơng mang gen vẫn có khả năng sống sót. Ngồi ra do kanamycin trong mơi trƣờng chọn lọc có thời gian sử dụng kéo dài làm mất tác dụng chọn lọc dẫn đến chọn lọc khơng hiệu quả. Do đó, việc tiến hành chọn lọc các chồi chuyển gen trên môi trƣờng tái sinh nhiều lần là cần thiết để loại bỏ chồi có khả năng không mang gen. Các chồi cịn sống sót trên mơi trƣờng chọn lọc nhiều lần có khả năng mang gen mục tiêu cao. Bùi Văn Thắng năm 2013 đã nghiên cứu thành công nồng độ kanamycin cho chọn lọc chồi chuyển gen từ mẫu thân mầm là 150 mg/l và nồng độ chọn lọc cho môi trƣờng ra rễ là 50 mg/l. Tuy nhiên mỗi vật liệu chuyển gen có khả năng đáp ứng với lƣợng kanamycin khác nhau. Nghiên cứu này sử dụng vật liệu chuyển gen là mô sẹo do đó cần xác định lại nồng độ của kanamycin cho chọn lọc chồi chuyển gen
3.2.1. Đánh giá ảnh hƣởng của hàm lƣợng kháng sinh kanamycin đến khả năng sống của mô sẹo năng sống của mô sẹo
Kết quả từ bảng 3.3 và biểu đồ 3.1 cho thấy kanamycin ảnh hƣởng trực tiếp tới khả năng sống của mơ sẹo. Tỉ lệ sống sót của chồi xoan ta tam bội tái sinh giảm mạnh từ 76,6% (75 mg/l kanamycin) xuống còn 2% (150 mg/l kanamycin). Ở nồng độc cao hơn (200 mg/l kanmycin) toàn bộ mẫu đều chết. Khi tăng nồng độ kanamycin lên 250 mg/l, khơng cịn mẫu nào sống trên môi trƣờng này kể từ lần chọn lọc thứ hai. Theo Brukhin và cs (2000), ngƣỡng nồng độ chất chọn lọc phù hợp khi loại bỏ đƣợc khoảng 90% các cây không chuyển gen. Căn cứ vào các kết quả trên, chúng tôi lựa chọn nồng độ kanamycin là 150mg/l (CT4) làm cơ sở để chọn lọc các cây xoan ta tam bội chuyển gen ở các thí nghiệm tiếp theo. Kết quả mô sẹo chƣa chuyển gen sau 3 lần chọn lọc đƣợc tính tốn với hàm ANOVA một nhân tố cho kết quả F>F crit, điều này chứng tỏ sự sai khác giữa các lần thí nghiệm và các cơng thức thí nghiệm là có ý ngĩa thống kê.
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của nồng độ kanamycin đến khả năng sống của mô sẹo CTTN Kanamycin CTTN Kanamycin (mg/l) Số mẫu Tỉ lệ mẫu sống lần 1 (%) Tỉ lệ mẫu sống lần 2 (%) Tỉ lệ mẫu sống lần 3 (%) ĐC 0 150 100±0 100±0 100±0 CT1 75 150 94,67±5,3 83,33±9,3 76,67±5,3 CT2 100 150 86±4 70±4 53,33±1,3 CT3 125 150 80±4 60,67±9,3 27,33±9,3 CT4 150 150 68,67±1,3 20,67±9,3 2±4 CT5 200 150 46±16 13,33±1,3 0±0 CT6 250 150 1,33±5,3 0±0 0±0
Biểu đồ 3.1. Ảnh hƣởng của nồng độ kanamycin đến khả năng sống của mô sẹo
0 20 40 60 80 100 120 ĐC CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 CT6 Lần 1 Lần 2 Lần 3 (%)
Các thí nghiệm trƣớc đã chọn đƣợc nồng độ kanamycin phù hợp cho sàng lọc thể nhận gen là 150 mg/l (CT4) và tiến hành thí nghiệm chuyển gen GS1 vào mô
sẹo xoan ta tam bội theo phƣơng pháp 2.3.3. Trên môi trƣờng này chỉ các tế bào chứa cấu trúc gen nptII mã hóa enzyme neomycin phosphotranferase có khả năng
phân giải kháng sinh kanamycin mới giúp tế bào sống sót và tái sinh chồi. Kết quả các chồi thu đƣợc trên môi trƣờng tái sinh có tiềm năng là các chồi chuyển gen. Kết quả nghiên cứu chuyển gen GS1 qua 3 lần chọn lọc đƣợc thể hiện ở bảng 3.4. Qua 3 đợt thí nghiệm tổng cộng có 990 mơ sẹo đồng ni cấy với vi khuẩn A. tumefaciens mang gen GS1 đƣợc chuyển lên môi trƣờng chọn lọc 150 mg/l kanamycin. Sau lần chọn lọc lần một thu đƣợc 801 mẫu sống, tỉ lệ sống trung bình đạt 80,897% . Các mẫu sống này tiếp tục đƣợc chuyển sang nuôi cấy chọn lọc lần hai thu đƣợc 377 mẫu sống (tỉ lệ sống 38,081%) và kết quả lần ba thu đƣợc 59 mẫu sống (tỉ lệ sống 5,959%) và 139 chồi tái sinh (hình 3.2).
Bảng 3.4. Kết quả chuyển gen GS1 vào mô sẹo
Đợt thí nghiệm Mẫu Số mẫu Số mẫu sống lần 1 Tỉ lệ sống lần 1 (%) Số mẫu sống lần 2 Tỉ lệ sống lần 2 (%) Số mẫu sống lần 3 Tỉ lệ sống lần 3 (%) Số chồi tái sinh Đợt 1 wt 325 224 69,04 70 21,47 8 2,46 16 CG 325 258 79,38 124 38,15 20 6,15 46 Đợt 2 wt 335 231 68,96 73 21,79 7 2,09 18 CG 335 274 81,79 128 38,21 21 6,27 51 Đợt 3 wt 330 220 66,67 68 20,61 7 2,12 15 CG 330 269 81,52 125 37,88 18 5,45 42
Hình 3.2. Mơ sẹo tái sinh qua ba lần chọn lọc
A. Mô sẹo chết, B, C, D mô sẹo tái sinh qua chọn lọc lần 1, 2, 3
Biểu đồ 3.2. Hiệu quả chọn lọc mô sẹo chuyển gen GS1
Hiệu suất chọn lọc qua mỗi lần chọn lọc đƣợc thể hiện trên biểu đồ 3.2. Nhƣ vậy qua ba lần chọn lọc, hiệu suất chọn lọc thu đƣợc là 5,959%. Hiệu suất trong
80,897 38,081 5,959 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Hiệu suất chọn lọc (%)
nghiên cứu này cao hơn so với các nghiên cứu trƣớc đây về xoan ta chuyển gen bằng thân mầm (5,73%) [6]. Điều này có thể giải thích rằng mơ sẹo chuyển gen có độ trẻ hóa cao hơn so với các vật liệu khác nên có thể tiếp nhận các khuẩn mang gen chuyển tốt hơn.
3.3. Đánh giá ảnh hƣởng của hàm lƣợng kháng sinh kanamycin đến khả năng ra rễ của chồi xoan ta tam bội chuyển gen ra rễ của chồi xoan ta tam bội chuyển gen
Các chồi sau ba lần chọn lọc sống đƣợc trên mơi trƣờng tái sinh chồi có chứa chất chọn lọc 150 mg/l kanamycin và có chiều cao 2 - 2,5 cm đƣợc tách thành từng chồi đơn lẻ và cấy chuyển sang mơi trƣờng ra rễ (½ MSI* + 0,5mg/l IBA + 0,2 mg/l IBA, có bổ sung thêm kanamycin để đánh giá khả năng ra rễ.
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của kanamycin đến khả năng ra rễ của chồi xoan ta tam bội không chuyển gen
Nồng độ Kanamycin (mg/l) Số chồi thí nghiệm Số chồi ra rễ Tỉ lệ chồi ra rễ (%) 0 60 59 98,3 25 60 48 80 50 60 29 48,3 75 60 3 5 100 60 0 0
Kết quả thu đƣợc ở bảng 3.5 cho thấy kanamycin có ảnh hƣởng đến quá trình ra rễ của các chồi xoan ta tam bội không chuyển gen, điều này là phù hợp theo báo cáo của tác giả Bùi Văn Thắng [12]. Đồng thời khác biệt giữa các cơng thức thí nghiệm này đƣợc chứng minh là có ý nghĩa thống kê (F>F crit). Ở các nồng độ kanamycin là 0; 25; 50 mg/l thì các chồi xoan ta tam bội khơng chuyển gen vẫn có khả năng ra rễ với tỉ lệ trung bình là 98,3 - 48,3%. Khi tăng nồng độ kanamycin lên
năng ra rễ, tỉ lệ chồi ra rễ đạt 5% và nồng độ kanamycin đạt 100 mg/l thì các chồi này hồn tồn khơng có khả năng ra rễ. Hình ảnh miêu tả cụ thể đƣợc thể hiện ở hình 3.3. Từ kết quả này cho thấy sử dụng kanamycin ở nồng độ 75 mg/l để chọn lọc ra rễ xoan ta tam bội chuyển gen là thích hợp.
Hình 3.3. Ảnh hƣởng của kanamycin đến khả năng ra rễ của chồi xoan ta tam bội không chuyển gen
A. Chồi xoan ta tam bội trên môi trƣờng nhân nhanh, B-F. Chồi xoan ta tam bội trên môi trƣờng ra rễ bổ sung kanamycin nồng độ lần lƣợt 0, 25, 50, 75, 100 mg/l
Kết quả nghiên cứu trƣớc đó đã đƣa ra đƣợc nồng độ kanamycin phù hợp cho chọn lọc ra rễ chồi xoan ta tam bội chuyển gen là 75 mg/l. Từ đó, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đánh giá chọn lọc các chồi xoan ta tam bội mang gen GS1, kết quả qua ba đợt nghiên cứu thu đƣợc nhƣ ở bảng 3.6. Theo đó, các mẫu đối chứng khơng chuyển gen (wt) có tổng 6 chồi ra rễ trên tổng số 139 chồi thí nghiệm, nhƣ vậy tỉ lệ ra rễ chỉ đạt 4,21%. Song song với đó là các chồi chuyển gen, trên mơi trƣờng ra rễ chọn lọc đã thu đƣợc 45 chồi chuyển gen ra rễ tạo cây hồn chỉnh, tỉ lệ ra rễ trung
bình chiếm 32,93%. 45 chồi ra rễ hoàn chỉnh này đƣợc đánh số dòng từ G1-G45, huấn luyện và chuyển ra trồng chăm sóc trong nhà lƣới để phục vụ phân tích sự có mặt của gen chuyển bằng phƣơng pháp sinh học phân tử.
Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của kanamycin đến khả năng ra rễ của chồi xoan ta tam bội chuyển gen
Đợt thí nghiệm Mẫu thí nghiệm Số chồi thí nghiệm Số chồi ra rễ Tỉ lệ chồi ra rễ (%) Đợt 1 wt 46 2 4,35 CG 46 18 39,13 Đợt 2 wt 51 3 5,88 CG 51 11 21,57 Đợt 3 wt 42 1 2,38 CG 42 16 38,10
Hình 3.4. Ảnh hƣởng của kanamycin đến khả năng ra rễ của chồi xoan ta tam bội chuyển gen
3.4. Kiểm tra sự có mặt của gen GS1 trong các dòng xoan ta tam bội chuyển
gen GS1
Để kiểm tra sự có mặt của gen GS1 trong các dòng cây đã vƣợt qua giai đoạn sàng lọc trên môi trƣờng ra rễ bổ sung kháng sinh chọn lọc thì tiến hành thu mẫu lá