2.3.5. Xác định cây chuyển gen bằng phƣơng pháp Southern blot
2.3.5.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số (lượng lớn) từ thực vật
DNA tổng số đƣợc tách đảm bảo độ tinh sạch cho phản ứng cắt với enzyme giới hạn. Đối với xoan ta tam bội chúng tôi tách chiết DNA bằng phƣơng pháp tách chiết CTAB với đệm chiết có chứa PVP, nhƣ sau:
(1) Tách DNA tổng số:
- Nghiền 1 g lá cây xoan ta, chia vào 5 ống eppendorft 2 ml.
- Bổ sung 750 µl đệm chiết CTAB (100 mM Tris- HCl pH8, 20 mM EDTA, 1,4 M NaCl, 2% CTAB, 1% PVP), ủ 60 phút ở 65oC, lắc đều mỗi 15 phút.
- Bổ sung 750 µl hỗn hợp Chloroform : Isoamylalcohol (24:1), đảo đều, ly tâm 12000 rpm trong 15 phút, thu dịch pha trên.
- Bổ sung isopropanol theo tỉ lệ 1:1, lắc đều, ly tâm 12000 rpm trong 15 phút, thu cặn DNA.
- Rửa cặn 2 lần với EtOH 70%. - Làm khơ DNA.
- Hịa tan DNA trong 50 µl dung dịch TE. (2) Tinh sạch DNA:
- Gom DNA tổng số sau khi tách ở 5 ống vào 1 ống eppendorft.
- Bổ sung 500 µl đệm TESC (100 mM Tris-HCl pH8, 20 mM EDTA, 0,4 M NaCl, 2% CTAB), đảo đều, ly tâm 6000 rpm trong 5 phút, thu cặn.
- Hòa cặn trong 500 µl TES (100mM Tris-HCl pH8, 20 mM EDTA, 1M NaCl).
- Bổ sung 500 µl isopropanol, ly tâm thu cặn DNA. - Rửa cặn DNA bằng EtOH 70%. Làm khơ DNA.
- Hịa cặn DNA trong 40 µl nƣớc deion có RNAse và điện di kiểm tra trên gel agarose 1%.
2.3.5.2. Phương pháp Southern blot
Cắt DNA hệ gen bằng enzym giới hạn: DNA tổng số (20 μg) của mỗi dòng
xoan ta tam bội chuyển gen đƣợc cắt bằng enzyme giới hạn XbaI trong 18 giờ ở
37oC với thành phần phản ứng nhƣ bảng 2.4. Thể tích enzyme cắt khơng vƣợt quá 10% tổng thể tích phản ứng.
ảng 2.4. Thành phần phản ứng cắt NA
Thành phần Thể tích cho phản ứng cắt NA tổng số
Enzyme XbaI (10u/µl) a/10 µl
Buffer (10X ) 20 µl
Mẫu a µg
Nƣớc Vừa đủ 200 µl
Điện di agarose: Các sản phẩm cắt đƣợc phân tách trên gel agarose 0,8% ở
điện thế 40 - 50V trong 14 giờ. Bản gel sau khi điện di đƣợc chụp ảnh, rửa với nƣớc cất, sau đó xử lí với dung dịch HCl 0,25 M trong 10 phút cho đến khi băng bromophenol blue ngả màu vàng và ngâm ngay vào dung dịch chuyển màng (NaOH 0,4M, NaCl 0,6M).
Chuyển màng: DNA đƣợc chuyển lên màng lai trong dung dịch kiềm (0,4M
NaOH). Theo đó, màng lai (membrane) đƣợc cắt vừa với bản gel (gel) và đặt dƣới bản gel, một cột giấy (paper towels) đƣợc đặt phía dƣới nhằm tạo áp lực thẩm thấu trong khi dung dịch chuyển màng (reservoir with transfer buffer) thấm truyền từ trên thông qua các tấm giấy lọc (Whatman 3MM wick) đƣợc cấp từ khay đựng buffer. Chuyển màng ít nhất 3h (với gel mỏng) hoặc qua đêm. Sau khi chuyển màng, màng lai đƣợc rửa với dung dịch SSC 2X và để khơ ở nhiệt độ phịng. sau đó cố định mẫu trên màng ở nhiệt độ 65oC, trong 2 giờ.
Tiền lai và lai: Màng lai đƣợc xử lí với dung dịch tiền lai (6X SSC, 5X
Denhardt’s solution, 0,5% SDS, 50% (v/v) deionized formamide, 50 µg/ml DNA tinh trùng cá hồi đã biến tính) (200 µl/cm2) ở 44ºC trong 4h. Sau đó, màng lai đƣợc lai với dung dịch lai chứa mẫu dò gen GS1 gắn Biotin (100 ng/ml) ở 42ºC qua đêm. Mẫu dò gắn biotin đƣợc tổng hợp dựa vào sản phẩm PCR của gen GS1 đƣợc nhân từ vector tách dòng theo hƣớng dẫn của bộ kit Biotin DecaLabel DNA Labeling Kit (Thermo Scientific).
Rửa màng: Màng đƣợc rửa 2 lần với đệm rửa 2X (SSC 2X bổ sung SDS
1%) ở nhiệt độ phòng, 1 lần với đệm rửa 1X ở 65oC – 15 phút, 2 lần với đệm rửa 0,1X ở 65o
C – 15 phút.
Hiện màng: Phức hợp enzyme Streptavidin-AP có khả năng bám gắn đặc
hiệu với gốc biotin trên mẫu dò (hình 2.3). Ngồi ra, enzyme Alkaline phosphatase có khả năng phân hủy BCIP-T (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphatase, p- toluidine salt) thành hợp chất có màu tím đen. Nhờ vậy có thể phát hiện mẫu dị gắn với doạn DNA cần nghiên cứu trên màng lai. Quy trình này đƣợc thực hiện theo hƣớng dẫn của bộ kit Biotin Chromogenic Detection Kit (Themoscience).
2.3.5. Phƣơng pháp đánh giá sinh trƣởng của các dòng xoan ta tam bội chuyển gen gen
2.3.5.1. Huấn luyện và trồng cây con trong điều kiện nhà lưới
Trong giai đoạn huấn luyện cây con in vitro, khi đƣa cây mô từ điều kiện
phịng thí nghiệm ra nhà lƣới cây con phải trải qua các giai đoạn thích nghi dần dần với điều kiện ánh sáng, nhiệt độ ngồi mơi trƣờng tự nhiên. Để nghiên cứu ảnh hƣởng của các loại giá thể tới cây mô đƣa ra vƣờn ƣơm, chúng tôi nghiên cứu phối trộn thành phần giá thể theo 4 công thức sau: GT1 (90% đất đồi + 10% trấu hun), GT2 (20% đất đồi + 80% mùn hữu cơ), GT3 (70% đất đồi + 30% trấu hun), GT4 (70% đất đồi + 20% mùn hữu cơ + 10% trấu hun). Từ đó đánh giá sức sống của cây xoan ta tam bội trong các mơi trƣờng giá thể khác nhau.
Thí nghiệm đƣợc bố trí với 3 lần lặp lại, mỗi lần là 30 cây cho một công thức giá thể. Cây trồng đƣợc chăm sóc nhƣ sau: tƣới nƣớc mỗi ngày 2 lần vào buổi sáng
và chiều tối với lƣợng nƣớc tƣới trung bình 4 lit/m2 trong 3 tháng đầu (Đoàn Thị Hoa, 2017).
2.3.5.2. Đánh giá các chỉ tiêu sinh lý của cây chuyển gen
Các dòng xoan ta tam bội chuyển gen GS1 đã đƣợc kiểm tra dƣơng tính với
phản ứng PCR, lai Southern và dòng đối chứng đƣợc lựa chọn để đánh giá khả năng sinh trƣởng trong điều kiện nhà lƣới. Các dòng này đƣợc nhân nhanh, ra rễ in vitro trên môi trƣờng bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin và đã tạo thành cây hoàn chỉnh. Sau khi chọn đƣợc công thức giá thể tối ƣu từ phƣơng pháp 2.3.5.1, tiến hành trồng các dòng xoan chuyển gen GS1 trong điều kiện nhà lƣới ba tháng giúp cây
thích nghi với mơi trƣờng bên ngoài. Từ tháng thứ tƣ các cây xoan ta tam bội chuyển gen sống của mỗi dòng đƣợc chuyển ra trồng trong khu vực có điều kiện cách ly vật lý bằng rào chắn và trồng keo (hoặc loài cây khác) xung quanh tạo vùng đệm cách ly cây xoan ta chuyển gen với mơi trƣờng xung quanh (hình 2.5). Các chỉ tiêu đánh giá sinh trƣởng của các dòng chuyển gen và dịng đối chứng khơng chuyển gen ở các giai đoạn phát triển khác nhau đƣợc tiến hành nhƣ sau:
Đánh giá khả năng sinh trƣởng về chiều cao: Đo chiều cao vút ngọn (Hvn) của các dòng xoan ta chuyển gen và đối chứng tính từ gốc cho đến đỉnh sinh trƣởng. Đánh giá khả năng sinh trƣởng về đƣờng kính: Đo đƣờng kính gốc (D00) và
đƣờng kính ngang ngực (D1,3).