Bảng 3 .1 Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng đến khả năng tạo mô sẹo
Bảng 3.3 Ảnh hƣởng của nồng độ kanamycin đến khả năng sống của mô sẹo
CTTN Kanamycin (mg/l) Số mẫu Tỉ lệ mẫu sống lần 1 (%) Tỉ lệ mẫu sống lần 2 (%) Tỉ lệ mẫu sống lần 3 (%) ĐC 0 150 100±0 100±0 100±0 CT1 75 150 94,67±5,3 83,33±9,3 76,67±5,3 CT2 100 150 86±4 70±4 53,33±1,3 CT3 125 150 80±4 60,67±9,3 27,33±9,3 CT4 150 150 68,67±1,3 20,67±9,3 2±4 CT5 200 150 46±16 13,33±1,3 0±0 CT6 250 150 1,33±5,3 0±0 0±0
Biểu đồ 3.1. Ảnh hƣởng của nồng độ kanamycin đến khả năng sống của mô sẹo
0 20 40 60 80 100 120 ĐC CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 CT6 Lần 1 Lần 2 Lần 3 (%)
Các thí nghiệm trƣớc đã chọn đƣợc nồng độ kanamycin phù hợp cho sàng lọc thể nhận gen là 150 mg/l (CT4) và tiến hành thí nghiệm chuyển gen GS1 vào mô
sẹo xoan ta tam bội theo phƣơng pháp 2.3.3. Trên môi trƣờng này chỉ các tế bào chứa cấu trúc gen nptII mã hóa enzyme neomycin phosphotranferase có khả năng
phân giải kháng sinh kanamycin mới giúp tế bào sống sót và tái sinh chồi. Kết quả các chồi thu đƣợc trên mơi trƣờng tái sinh có tiềm năng là các chồi chuyển gen. Kết quả nghiên cứu chuyển gen GS1 qua 3 lần chọn lọc đƣợc thể hiện ở bảng 3.4. Qua 3 đợt thí nghiệm tổng cộng có 990 mơ sẹo đồng ni cấy với vi khuẩn A. tumefaciens mang gen GS1 đƣợc chuyển lên môi trƣờng chọn lọc 150 mg/l kanamycin. Sau lần chọn lọc lần một thu đƣợc 801 mẫu sống, tỉ lệ sống trung bình đạt 80,897% . Các mẫu sống này tiếp tục đƣợc chuyển sang nuôi cấy chọn lọc lần hai thu đƣợc 377 mẫu sống (tỉ lệ sống 38,081%) và kết quả lần ba thu đƣợc 59 mẫu sống (tỉ lệ sống 5,959%) và 139 chồi tái sinh (hình 3.2).
Bảng 3.4. Kết quả chuyển gen GS1 vào mơ sẹo
Đợt thí nghiệm Mẫu Số mẫu Số mẫu sống lần 1 Tỉ lệ sống lần 1 (%) Số mẫu sống lần 2 Tỉ lệ sống lần 2 (%) Số mẫu sống lần 3 Tỉ lệ sống lần 3 (%) Số chồi tái sinh Đợt 1 wt 325 224 69,04 70 21,47 8 2,46 16 CG 325 258 79,38 124 38,15 20 6,15 46 Đợt 2 wt 335 231 68,96 73 21,79 7 2,09 18 CG 335 274 81,79 128 38,21 21 6,27 51 Đợt 3 wt 330 220 66,67 68 20,61 7 2,12 15 CG 330 269 81,52 125 37,88 18 5,45 42
Hình 3.2. Mơ sẹo tái sinh qua ba lần chọn lọc
A. Mô sẹo chết, B, C, D mô sẹo tái sinh qua chọn lọc lần 1, 2, 3
Biểu đồ 3.2. Hiệu quả chọn lọc mô sẹo chuyển gen GS1
Hiệu suất chọn lọc qua mỗi lần chọn lọc đƣợc thể hiện trên biểu đồ 3.2. Nhƣ vậy qua ba lần chọn lọc, hiệu suất chọn lọc thu đƣợc là 5,959%. Hiệu suất trong
80,897 38,081 5,959 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Hiệu suất chọn lọc (%)
nghiên cứu này cao hơn so với các nghiên cứu trƣớc đây về xoan ta chuyển gen bằng thân mầm (5,73%) [6]. Điều này có thể giải thích rằng mơ sẹo chuyển gen có độ trẻ hóa cao hơn so với các vật liệu khác nên có thể tiếp nhận các khuẩn mang gen chuyển tốt hơn.
3.3. Đánh giá ảnh hƣởng của hàm lƣợng kháng sinh kanamycin đến khả năng ra rễ của chồi xoan ta tam bội chuyển gen ra rễ của chồi xoan ta tam bội chuyển gen
Các chồi sau ba lần chọn lọc sống đƣợc trên môi trƣờng tái sinh chồi có chứa chất chọn lọc 150 mg/l kanamycin và có chiều cao 2 - 2,5 cm đƣợc tách thành từng chồi đơn lẻ và cấy chuyển sang mơi trƣờng ra rễ (½ MSI* + 0,5mg/l IBA + 0,2 mg/l IBA, có bổ sung thêm kanamycin để đánh giá khả năng ra rễ.
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của kanamycin đến khả năng ra rễ của chồi xoan ta tam bội không chuyển gen
Nồng độ Kanamycin (mg/l) Số chồi thí nghiệm Số chồi ra rễ Tỉ lệ chồi ra rễ (%) 0 60 59 98,3 25 60 48 80 50 60 29 48,3 75 60 3 5 100 60 0 0
Kết quả thu đƣợc ở bảng 3.5 cho thấy kanamycin có ảnh hƣởng đến q trình ra rễ của các chồi xoan ta tam bội không chuyển gen, điều này là phù hợp theo báo cáo của tác giả Bùi Văn Thắng [12]. Đồng thời khác biệt giữa các công thức thí nghiệm này đƣợc chứng minh là có ý nghĩa thống kê (F>F crit). Ở các nồng độ kanamycin là 0; 25; 50 mg/l thì các chồi xoan ta tam bội khơng chuyển gen vẫn có khả năng ra rễ với tỉ lệ trung bình là 98,3 - 48,3%. Khi tăng nồng độ kanamycin lên
năng ra rễ, tỉ lệ chồi ra rễ đạt 5% và nồng độ kanamycin đạt 100 mg/l thì các chồi này hồn tồn khơng có khả năng ra rễ. Hình ảnh miêu tả cụ thể đƣợc thể hiện ở hình 3.3. Từ kết quả này cho thấy sử dụng kanamycin ở nồng độ 75 mg/l để chọn lọc ra rễ xoan ta tam bội chuyển gen là thích hợp.
Hình 3.3. Ảnh hƣởng của kanamycin đến khả năng ra rễ của chồi xoan ta tam bội không chuyển gen
A. Chồi xoan ta tam bội trên môi trƣờng nhân nhanh, B-F. Chồi xoan ta tam bội trên môi trƣờng ra rễ bổ sung kanamycin nồng độ lần lƣợt 0, 25, 50, 75, 100 mg/l
Kết quả nghiên cứu trƣớc đó đã đƣa ra đƣợc nồng độ kanamycin phù hợp cho chọn lọc ra rễ chồi xoan ta tam bội chuyển gen là 75 mg/l. Từ đó, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đánh giá chọn lọc các chồi xoan ta tam bội mang gen GS1, kết quả qua ba đợt nghiên cứu thu đƣợc nhƣ ở bảng 3.6. Theo đó, các mẫu đối chứng khơng chuyển gen (wt) có tổng 6 chồi ra rễ trên tổng số 139 chồi thí nghiệm, nhƣ vậy tỉ lệ ra rễ chỉ đạt 4,21%. Song song với đó là các chồi chuyển gen, trên mơi trƣờng ra rễ chọn lọc đã thu đƣợc 45 chồi chuyển gen ra rễ tạo cây hoàn chỉnh, tỉ lệ ra rễ trung
bình chiếm 32,93%. 45 chồi ra rễ hồn chỉnh này đƣợc đánh số dịng từ G1-G45, huấn luyện và chuyển ra trồng chăm sóc trong nhà lƣới để phục vụ phân tích sự có mặt của gen chuyển bằng phƣơng pháp sinh học phân tử.
Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của kanamycin đến khả năng ra rễ của chồi xoan ta tam bội chuyển gen
Đợt thí nghiệm Mẫu thí nghiệm Số chồi thí nghiệm Số chồi ra rễ Tỉ lệ chồi ra rễ (%) Đợt 1 wt 46 2 4,35 CG 46 18 39,13 Đợt 2 wt 51 3 5,88 CG 51 11 21,57 Đợt 3 wt 42 1 2,38 CG 42 16 38,10
Hình 3.4. Ảnh hƣởng của kanamycin đến khả năng ra rễ của chồi xoan ta tam bội chuyển gen
3.4. Kiểm tra sự có mặt của gen GS1 trong các dòng xoan ta tam bội chuyển
gen GS1
Để kiểm tra sự có mặt của gen GS1 trong các dịng cây đã vƣợt qua giai đoạn sàng lọc trên môi trƣờng ra rễ bổ sung kháng sinh chọn lọc thì tiến hành thu mẫu lá của của tất cả 45 cây xoan ta tam bội chuyển gen và cây xoan ta tam bội không chuyển gen là đối chứng để tách chiết DNA tổng số. Kết quả thể hiện ở hình 3.5 và phụ lục bảng B.1
Kết quả tách chiết DNA cho thấy DNA tổng số thu đƣợc với hàm lƣợng tƣơng đối lớn, ít bị đứt gãy và đảm bảo đủ yêu cầu để tiến hành phản ứng PCR.
Hình 3.5: Kết quả điện di DNA tổng số của các dòng cây trên gel agarose 1%
WT. DNA tổng số của cây đối chứng không chuyển gen, 1-45. DNA tổng số của các dòng xoan ta tam bội chuyển gen G1-G45
Để kiểm tra sự có mặt của gen GS1 trong các dòng xoan ta chuyển gen,
chúng tôi thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho đoạn gen GS1 trong vector pBI121. Chu trình nhiệt và trình tự các cặp mồi sử dụng nhƣ đã miêu tả ở mục 2.3.4.2. Kết quả PCR đƣợc kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 1% và đƣợc chụp lại bằng máy chụp ảnh gel, thu đƣợc nhƣ sau:
Hình 3.6: Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR các dòng cây chuyển gen GS1
M. Marker 1kb, (-). Đối chứng âm, (wt). Cây đối chứng không chuyển gen, (+). Plasmid của vi khuẩn A. tumefaciens mang gen GS1,
1-45. Các dòng cây chuyển gen G1-G45. Điện di trên gel agarose 1%
Kết quả trên hình 3.6 cho thấy sản phẩm PCR của đối chứng dƣơng (vi khuẩn A. Tumefaciens mang vector chuyển gen GS1) và 22 dòng xoan ta tam bội
chuyển gen GS1 (G1, G3, G4, G5, G6, G8, G9, G10, G12, G13, G14, G17, G19,
G22, G23, G24, G25, G26, G27, G28, G30, G45) đều xuất hiện 1 băng DNA đặc hiệu duy nhất và rõ nét với kích thƣớc tƣơng ứng khoảng 528bp, đúng với kích thƣớc theo lý thuyết của gen GS1. Trong khi ở cây đối chứng âm thứ nhất (DNA
đƣợc thay thế bằng nƣớc) và đối chứng âm thứ hai sử dụng DNA của chồi xoan ta tam bội khơng chuyển gen thì đều khơng phát hiện đƣợc băng nào. Vì vậy, chúng tơi đƣa ra kết luận, 22 dịng xoan ta tam bội (G1, G3, G4, G5, G6, G8, G9, G10, G12, G13, G14, G17, G19, G22, G23, G24, G25, G26, G27, G28, G30, G45) đã mang cấu trúc gen chuyển GS1.
3.5. Kết quả phân tích các dịng xoan ta tam bội chuyển gen GS1 bằng kĩ thuật Southern blot Southern blot
Với mục đích xác định chắc chắn các dòng xoan ta tam bội chuyển gen GS1, chúng tôi đã tiến hành theo phƣơng pháp 1.6.2.2, tách chiết DNA tổng số của 22 dòng chuyển gen có phản ứng dƣơng tính với phản ứng PCR sau đó tinh sạch, xử lý với RNAse.
Hình 3.7. Kết quả điện di sản phẩm NA tổng số
wt. DNA tổng số của cây đối chứng không chuyển gen; 2, 3, 4, 9, 22. DNA tổng số của các dòng xoan ta tam bội chuyển gen GS1 (G2, G3, G4, G9, G22)
Kết quả xoan ta tam bội cho thấy các băng DNA tổng số tƣơng đối sắc nét kiểm tra nồng độ và điện di DNA tổng số các mẫu, rõ ràng chứng tỏ DNA tổng số thu đƣợc khá ngun vẹn, ít đứt gãy (hình 3.7).
ảng 3.7. Nồng độ NA của các mẫu sau tinh sạch Mẫu Nồng độ NA (ng/µl) OD260/OD280 wt 372,5 1,78 G2 431,7 1,81 G3 301,3 1,97 G4 297,9 1,65 G9 412,3 1,94
G22 425,2 1,82
Kết quả đo nồng độ và độ tinh sạch của DNA tổng số bằng máy đo quang phổ hấp thụ Nanodrop (bảng 3.7) cho thấy các mẫu DNA tổng số thu đƣợc với hàm lƣợng tƣơng đối lớn, độ tinh sạch khá cao, đáp ứng đủ yêu cầu cho phản ứng cắt bằng enzyme.
Trong thí nghiệm này chúng tôi cắt DNA tổng số bằng enzyme giới hạn XbaI do nó chỉ cắt tại 1 điểm ngay tại đầu gen GS1- điểm nối với 35S promoter trong
trình tự đoạn T-DNA trong vector chuyển gen pBI121/GS1. Bên cạnh đó, enzyme
XbaI khơng cắt vào gen đang nghiên cứu, khơng cắt ở hai đầu gen, có thể cắt ở một
trong hai phía của gen nghiên cứu, phổ biến và kinh tế. Kết quả cắt bằng XbaI đƣợc thể hiện ở hình 3.8. So sánh với giếng đối chứng là sản phẩm DNA tổng số chƣa cắt bằng enzyme giới hạn, kết quả điện di cho thấy DNA tổng số của dòng xoan ta tam bội khơng chuyển gen (wt) và 5 dịng xoan ta tam bội chuyển gen GS1 đã đƣợc cắt tƣơng đối hoàn toàn, đảm bảo yêu cầu cho phản ứng lai với mẫu dị đặc hiệu.
Hình 3.8. Kết quả điện di sản phẩm cắt NA tổng số bằng enzyme XbaI
ĐC: DNA tổng số chƣa cắt; wt: dòng xoan ta tam bội không chuyển gen; 2, 3, 4, 9, 22. các dòng cây chuyển gen tƣơng ứng G2, G3, G4, G9, G22
DNA tổng số sau cắt đƣợc điện di và thấm chuyển từ bản gel agarose lên màng nylon tích điện dƣơng (Hybond-N+, Amersham) và đƣợc lai với mẫu dò là sản phẩm PCR của gen GS1 có đánh dấu biotin theo quy trình lai của bộ kit. Kết
quả lai Southern đƣợc minh họa ở hình 3.9 cho thấy gen GS1 đƣợc gắn vào genome cây ở những vị trí khác nhau với những dòng cây khác nhau. Do nghiên cứu sử dụng enzyme cắt là XbaI chỉ cắt tại 1 điểm nên mỗi băng tƣơng ứng với 1 bản copy của gen chuyển. Kết quả Southern blot cho thấy, trong 5 dịng phân tích có 2 dịng chuyển gen G3 và G4 có một vạch băng DNA hiện rõ trên màng lai, chứng tỏ các dịng này có 1 bản copy của gen GS1 ở trong cây. Đồng thời, kết quả phân tích cho thấy kích thƣớc của các băng vạch này là khác nhau giữa các dịng, chứng tỏ vị trí gắn của gen trong genome là khác nhau và đây là các dòng chuyển gen riêng biệt. Dòng G2, G9, G22 khơng có băng DNA hiện rõ nên đƣợc coi là âm tính với Southern blot. Dịng wt khơng xuất hiện băng vạch nào do đây là cây không chuyển gen. Giếng P (đối chứng dƣơng) do plasmid chƣa cắt nên xuất hiện 1 băng duy nhất khi tiến hành phản ứng lai. Kết quả này cho thấy 2 dòng G3, G4 là các dòng đã đƣợc chuyển gen GS1.
Hình 3.9. Kết quả Southern blot các mẫu xoan ta tam bội chuyển gen GS1
P. vector pBI121-GS1; wt. dòng xoan ta tam bội không chuyển gen; 2, 3, 4, 9, 22. các dòng cây chuyển gen tƣơng ứng G2, G3, G4, G9, G22
Kết quả phân tích Southern blot các dịng xoan ta chuyển gen GS1 đƣợc thống kê ở bảng 3.8. Trong tổng số 22 dòng xoan ta tam bội chuyển gen dƣơng tính với PCR, có 4 dịng đƣợc xác định dƣơng tính với lai Southern; trong đó dịng số G3, G4 chỉ có 1 băng của gen GS1; dịng G1 có 2 băng; dịng G12 có nhiều hơn 1 băng nhƣng chƣa xác định đƣợc số lƣợng cụ thể do các băng vạch phân tách nhau kém và DNA tổng số chƣa cắt đƣợc hoàn toàn. Nhƣ vậy sau q trình phân tích bằng kỹ thuật Southern blot, kết quả cuối cùng đã chọn lọc đƣợc 4 dòng mang gen chuyển G1, G3, G4, G12.
ảng 3.8. Tổng hợp kết quả phân tích Southern blot các dịng xoan ta tam bội chuyển gen GS1
òng xoan ta tam bôi chuyển gen
Kết quả Southern blot
Số băng của gen
GS1 G1 Dƣơng tính 2 G3 Dƣơng tính 1 G4 Dƣơng tính 1 G5 Âm tính - G6 Âm tính - G8 Âm tính - G9 Âm tính - G10 Âm tính - G12 Dƣơng tính >1 G13 Âm tính - G14 Âm tính - G17 Âm tính - G19 Âm tính -
G22 Âm tính - G23 Âm tính - G24 Âm tính - G25 Âm tính - G26 Âm tính - G27 Âm tính - G28 Âm tính - G30 Âm tính - G45 Âm tính -
3.6. Phƣơng pháp đánh giá sinh trƣởng của các dòng xoan ta tam bội chuyển gen gen
3.6.1. Đánh giá ảnh hƣởng của thành phần giá thể đến tỉ lệ sống dòng xoan ta tam bội tam bội
Khi đã tạo đƣợc cây hoàn chỉnh, giai đoạn huấn luyện và đƣa cây con in vitro dần thích nghi với điều kiện tự nhiên là rất khó khăn, mỗi lồi cây thích hợp với mỗi loại giá thể khác nhau. Do đó, thành phần giá thể có vai trị rất quan trọng trong việc ƣơm cây in vitro, quyết định nhiều đến tỉ lệ sống của cây, cũng nhƣ khả năng cung cấp chất dinh dƣỡng độ thơng thống cho rễ hút nƣớc sinh trƣởng trên điều kiện khác mơi trƣờng phịng thí nghiệm giai đoạn mới đƣa cây ra trồng. Cây con xoan ta tam bội in vitro ra rễ hoàn chỉnh trong phịng thí nghiệm sau bốn tuần đƣợc đƣa ra huấn luyện ngồi mơi trƣờng tự nhiên từ 5-7 ngày. Sau đó tiến hành trồng cây vào bốn môi trƣờng giá thể đã đƣợc mô tả ở phần 2.3.5.1, kết quả thu đƣợc sau ba tháng thử nghiệm nhƣ sau:
Biểu đồ 3.3. Ảnh hƣởng của giá thể lên tỉ lệ sống của cây con sau 3 tháng
Kết quả từ biểu đồ 3.3 cho thấy rằng các dòng xoan ta tam bội có sức sống khác biệt khi trồng trong bốn cơng thức giá thể, khác biệt này có ý nghĩa thống kê (F>F crit). Trong đó, cơng thức giá thể có chứa thành phần mùn hữu cơ cung cấp dinh dƣỡng cũng nhƣ tạo độ xốp của đất. Do đó, giá thể này giúp tăng sức sống của cây con lên đến 66,63% ở công thức giá thể GT2 (80% mùn hữu cơ) và đạt 49,67%