P. vector pBI121-GS1; wt. dịng xoan ta tam bội khơng chuyển gen; 2, 3, 4, 9, 22. các dòng cây chuyển gen tƣơng ứng G2, G3, G4, G9, G22
Kết quả phân tích Southern blot các dòng xoan ta chuyển gen GS1 đƣợc thống kê ở bảng 3.8. Trong tổng số 22 dòng xoan ta tam bội chuyển gen dƣơng tính với PCR, có 4 dịng đƣợc xác định dƣơng tính với lai Southern; trong đó dịng số G3, G4 chỉ có 1 băng của gen GS1; dịng G1 có 2 băng; dịng G12 có nhiều hơn 1 băng nhƣng chƣa xác định đƣợc số lƣợng cụ thể do các băng vạch phân tách nhau kém và DNA tổng số chƣa cắt đƣợc hoàn toàn. Nhƣ vậy sau q trình phân tích bằng kỹ thuật Southern blot, kết quả cuối cùng đã chọn lọc đƣợc 4 dòng mang gen chuyển G1, G3, G4, G12.
ảng 3.8. Tổng hợp kết quả phân tích Southern blot các dịng xoan ta tam bội chuyển gen GS1
ịng xoan ta tam bơi chuyển gen
Kết quả Southern blot
Số băng của gen
GS1 G1 Dƣơng tính 2 G3 Dƣơng tính 1 G4 Dƣơng tính 1 G5 Âm tính - G6 Âm tính - G8 Âm tính - G9 Âm tính - G10 Âm tính - G12 Dƣơng tính >1 G13 Âm tính - G14 Âm tính - G17 Âm tính - G19 Âm tính -
G22 Âm tính - G23 Âm tính - G24 Âm tính - G25 Âm tính - G26 Âm tính - G27 Âm tính - G28 Âm tính - G30 Âm tính - G45 Âm tính -
3.6. Phƣơng pháp đánh giá sinh trƣởng của các dòng xoan ta tam bội chuyển gen gen
3.6.1. Đánh giá ảnh hƣởng của thành phần giá thể đến tỉ lệ sống dòng xoan ta tam bội tam bội
Khi đã tạo đƣợc cây hoàn chỉnh, giai đoạn huấn luyện và đƣa cây con in vitro dần thích nghi với điều kiện tự nhiên là rất khó khăn, mỗi lồi cây thích hợp với mỗi loại giá thể khác nhau. Do đó, thành phần giá thể có vai trị rất quan trọng trong việc ƣơm cây in vitro, quyết định nhiều đến tỉ lệ sống của cây, cũng nhƣ khả năng cung cấp chất dinh dƣỡng độ thơng thống cho rễ hút nƣớc sinh trƣởng trên điều kiện khác môi trƣờng phịng thí nghiệm giai đoạn mới đƣa cây ra trồng. Cây con xoan ta tam bội in vitro ra rễ hồn chỉnh trong phịng thí nghiệm sau bốn tuần đƣợc đƣa ra huấn luyện ngồi mơi trƣờng tự nhiên từ 5-7 ngày. Sau đó tiến hành trồng cây vào bốn môi trƣờng giá thể đã đƣợc mô tả ở phần 2.3.5.1, kết quả thu đƣợc sau ba tháng thử nghiệm nhƣ sau:
Biểu đồ 3.3. Ảnh hƣởng của giá thể lên tỉ lệ sống của cây con sau 3 tháng
Kết quả từ biểu đồ 3.3 cho thấy rằng các dịng xoan ta tam bội có sức sống khác biệt khi trồng trong bốn công thức giá thể, khác biệt này có ý nghĩa thống kê (F>F crit). Trong đó, cơng thức giá thể có chứa thành phần mùn hữu cơ cung cấp dinh dƣỡng cũng nhƣ tạo độ xốp của đất. Do đó, giá thể này giúp tăng sức sống của cây con lên đến 66,63% ở công thức giá thể GT2 (80% mùn hữu cơ) và đạt 49,67% ở công thức GT4 (10% mùn hữu cơ). Bên cạnh đó, các cơng thức giá thể GT1 và GT3 không bổ sung thành phần mùn hữu cơ, tỷ lệ sống của cây con chỉ đạt 36,67% (công thức GT3) và 10,67% (GT1). Nhƣ vậy, thành phần giá thể ở công thức GT2 tạo điều kiện sống cho cây xoan ta tam bội là tốt nhất so với ba cơng thức cịn lại.
3.6.2. Đánh giá khả năng sinh trƣởng về chiều cao của các dòng xoan ta tam bội chuyển gen GS1
Trong ba tháng đầu, các dòng xoan ta tam bội chuyển gen GS1 (G1, G3, G4, G12, G13, G30) và dòng đối chứng âm khơng chuyển gen đƣợc nhân giống vơ tính và trồng trong bầu đất với cơng thức giá thể GT2 ở điều kiện nhà lƣới có cùng điều kiện về nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng và dinh dƣỡng. Bắt đầu từ tháng thứ tƣ, các cây con đƣợc chuyển sang trồng ở vƣờn ƣơm. Mỗi lơ thí nghiệm đƣợc bố trí số lƣợng cây con tối thiểu là 30 cây với 3 lần lặp lại. Chiều cao của các dòng xoan ta tam bội
10,67 66,67 36,67 49,67 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 GT1 GT2 GT3 GT4 Tỷ lệ sống (%)
chuyển gen và cây đối chứng không chuyển gen đƣợc xác định 3 tháng 1 lần ( tháng thứ 1 đến tháng thứ 15) khi đƣa từ phịng thí nghiệm ra trồng ngoài vƣờn ƣơm.
Kết quả thu đƣợc nhƣ bảng 3.10 cho thấy, các dòng xoan chuyển gen GS1
sau 15 tháng có sự phát triển nhanh vƣợt trội hơn so với dòng đối chứng từ 140,22 - 182,05%. Đồng thời ở giai đoạn cây từ 1 - 3 tháng tuổi cây có sự tăng trƣởng thấp, các cây dịng chuyển gen có tốc độc tăng trƣởng trung bình mỗi tháng là 9,14 cm cịn cây đối chứng tăng trung bình 3,08 cm. Do giai đoạn đầu cây con chủ yếu tập trung thích nghi với mơi trƣờng và cho đến các tháng tuổi tiếp theo sự tăng trƣởng về chiều cao mới đƣợc rõ rệt hơn. Đặc biệt đến tháng thứ 15 các dòng chuyển gen G1, G3, G4 và G12 có sự phát triển trung bình về chiều cao gấp 159,98% so với đối chứng. Trong đó, dịng G1 và G3 có sự tăng trƣởng về chiều cao lớn nhất (trên 160%) và chiều cao trung bình đạt đƣợc lên đến 435,53 cm còn đối chứng chỉ cao trung bình 239,24 cm. Theo tính tốn thống kê bằng phƣơng pháp ANOVA 2 nhân tố, chúng tôi thu đƣợc kết quả sự khác biệt về tăng trƣởng chiều cao giữa các dòng xoan ta tam bội chuyển gen GS1 với nhau, với đối chứng và giữa các thời điểm thu thập kết quả là khác biệt mang tính thống kê (F>F crit). Nhƣ vậy, sự khác biệt này cho thấy mức độ biểu hiện gen trong các dòng cây mang gen chuyển là khác nhau và vƣợt trội hơn hẳn so với dòng cây đối chứng.
Bảng 3.10. Sinh trƣởng về chiều cao của cây xoan ta (Hvn)
1 tháng (cm) 3 tháng (cm) 6 tháng (cm) 9 tháng (cm) 12 tháng (cm) 15 tháng (cm) Tỉ lệ tăng trƣờng sau 15 tháng (%) ĐC 6,75 9,83 68,08 125,58 177,57 239,24 100 G1 9,72 21,28 116,37 224,05 357,42 435,53 182,05 G3 9,13 19,64 93,25 191,17 308,08 387,27 161,88 G4 9,13 17,42 108,73 179,73 267,27 335,47 140,22
G12 7,80 18,46 103,25 193,08 288,92 372,64 155,76
3.6.3. Đánh giá khả năng sinh trƣởng về đƣờng kính của các dịng xoan ta tam bội chuyển gen GS1 bội chuyển gen GS1
Ngoài đánh giá sinh trƣởng theo chỉ tiêu chiều cao cây, chúng tôi sử dụng đồng thời chỉ số đƣờng kính gốc để so sánh. Sau khi đo đƣờng kính gốc (D00) và đƣờng kính ngang ngực (D1,3) của các cây thuộc các dòng xoan ta tam bội chuyển
gen và đối chứng, chúng tơi đã tính tốn và thu đƣợc kết quả nhƣ bảng 3.11 và bảng 3.12 nhƣ sau:
Bảng 3.11. Sinh trƣởng về đƣờng kính gốc của cây xoan ta (D00)
1 tháng (mm) 3 tháng (mm) 6 tháng (mm) 9 tháng (mm) 12 tháng (mm) 15 tháng (mm) Tỉ lệ tăng trƣờng sau 15 tháng (%) ĐC 0,6 2,35 5,49 10,24 12,77 21,03 100 G1 0,96 4,01 7,12 19,66 22,19 43,21 205,47 G3 0,79 3,5 7,01 14,35 19,23 33,87 161,06 G4 0,84 3,88 6,59 17,84 18,94 27,72 131,81 G12 0,89 3,67 6,99 18,12 20,49 30,89 146,89
Bảng 3.12. Sinh trƣởng về đƣờng kính ngang ngực của cây xoan ta (D1,3)
9 tháng (mm) 12 tháng (mm) 15 tháng (mm) Tỉ lệ tăng trƣờng sau 15 tháng (%) ĐC 9,61 12,17 19,54 100 G1 18,87 21,49 39,36 201,43
G3 13,81 18,87 29,18 149,33
G4 16,76 17,36 23,73 121,44
G12 17,01 19,21 27,55 140,99
Kết quả cho thấy đƣờng kính gốc và đƣờng kính ngang ngực của 4 dòng xoan chuyển gen GS1 đều cao hơn so với đối chứng tính đến thời điểm 15 tháng sau khi trồng thử nghiệm. Về đƣờng kính gốc các dịng chuyển gen to gấp 131,81 - 205,47% so với đối chứng. Trong đó đáng kể đến là dịng G1 có tỉ lệ tăng trƣởng đƣờng kính gốc cao nhất (205,47%) và đƣờng kính trung bình đạt đƣợc lên tới 43,21 mm. Tiếp đến là dòng G3 (33.87 mm), dịng G12 (20,49 mm) và dịng G4 có đƣờng kính gốc trung bình đến tháng thứ 15 là thấp nhất trong 4 dòng chuyển gen, đạt 27,72 mm nhƣng vẫn cao hơn so với đối chứng 6,69 mm. Về giá trị đƣờng kính ngang ngực cũng cho kết quả tƣơng tự nhƣ đối với giá trị đƣờng kính gốc. Tuy nhiên tỉ lệ tăng trƣởng so với đối chứng lại thấp hơn đạt 121,44 - 201,43%. Đƣờng kính ngang ngực giữa các dịng chuyển gen và dịng đối chứng có sự khác biệt đáng kể và mang tính thống kê (F>F crit). Sau 15 tháng trồng ngoài vƣờn nhân giống, dịng G1 có đƣờng kính ngang ngực trung bình cao nhất đạt 39,36 mm, lớn hơn đối chứng 19,82 mm (tƣơng đƣơng với 201,43%), các dòng chuyển gen G3, G4, G12 cũng lần lƣợt đạt 29,18 mm, 23,73 mm, 27,55 mm và đều cao hơn so với đối chứng (19,54 mm).
Từ hai kết quả đánh giá chiều cao cây và đƣờng kính của các dịng xoan ta tam bội chuyển gen GS1 cho thấy cả 4 dòng chuyển gen G1, G3, G4, G12 đều sinh trƣởng vƣợt trội hơn so với đối chứng, trong đó dịng G1 và G3 có khả năng sinh trƣởng tốt và ổn định hơn so với các dòng còn lại G4, G12 và so với đối chứng. Kết quả này cũng tƣơng đồng với các nghiên cứu trƣớc đó của Gallardo và cs năm 1999.
Hình 3.10. Sinh trƣởng của các dòng xoan ta tam bội
A. Cây 3 tháng tuối, B. Cây 6 tháng tuổi,
KẾT LUẬN
Từ những kết quả đã nghiên cứu, chúng tôi rút ra đƣợc những kết luận sau: + Mơi trƣờng thích hợp tạo mơ sẹo xoan ta tam bội in vitro là MS + 1 mg/l
BAP + 3 mg/l NAA + 20g/l sucrose + 6 g/l aga với tỉ lệ tạo mơ sẹo trung bình đạt 87,3%.
+ Môi trƣờng bổ sung 150 mg/l kháng sinh kanamycin cho hiệu quả chọn lọc mẫu mô sẹo chuyển gen tối ƣu. Hiệu suất chuyển gen vào mô sẹo xoan ta tam bội đạt 5,959%.
+ Môi trƣờng chọn lọc ra rễ chọn lọc tối ƣu chồi xoan ta tam bội chuyển gen là kanamycin nồng độ 75 mg/l (tỉ lệ ra rễ đạt 32,93%).
+ Bốn dòng chuyển gen dƣơng tính với kết quả PCR và lai Southern blot gồm: dòng G1, G3, G4 và dòng G12.
+ Sau 15 tháng tại vƣờn ƣơm, hai dòng chuyển gen G1, G3 có giá trị sinh trƣởng cao nhất và cao hơn đối chứng 174,98 - 206,62% ở giá trị chiều cao vút ngọn, gấp 161,06 - 205,47% ở giá trị đƣờng kính gốc và gấp 149,33 - 201,43% tại giá trị đƣờng kính ngang ngực.
KIẾN NGHỊ
Với những kết quả thu đƣợc, chúng tôi xin đƣa ra một số hƣớng nghiên cứu tiếp theo nhƣ sau:
+ Kéo dài thời gian theo dõi sinh trƣởng của các dòng xoan ta tam bội chuyển gen GS1 và dòng đối chứng.
+ Tiến hành đánh giá biểu hiện của gen chuyển thông qua các kỹ thuật nhƣ RT-PCR hay Western blot.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt:
1. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Ứng dụng công nghệ tế bào
thực vật trong cải tiến giống cây trồng, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội.
2. Lê Mộng Chân, Lê Thị Huyên (2000), Thực vật rừng, Nhà xuất bản Nông
nghiệp, Hà Nội.
3. Võ Văn Chi (2004), Từ điển thực vật thông dụng (tập 2), Nhà xuất bản Khoa học và Kĩ thuật.
4. Nguyễn Việt Cƣờng (2010), Nghiên cứu lai giống nhóm lồi xoan để tạo giống
mới có những đặc điểm ưu việt, Viện khoa học Lâm nghiệp Việt Nam.
5. Đỗ Xuân Đồng, Bùi Văn Thắng, Hồ Văn Giảng, Nơng Văn Hải, Chu Hồng Hà (2008), “Nghiên cứu hệ thống tái sinh cây xoan ta ( Melia azedarach L.) thông qua phôi soma từ thân mầm phục vụ chuyển gen”, Tạp chí cơng nghệ sinh học, số 2 tr.227-232.
6. Hồ Văn Giảng, Hà Văn Huân, Vũ Kim Dung, Chu Hoàng Hà, Bùi Văn Thắng (2011), “Tạo giống xoan ta (Melia azedarach L.) sinh trƣởng nhanh bằng kỹ thuật chuyển gen”, Tạp chí Nơng nghiệp và phát triển nơng thơn, 11-14. 7. Trần Thị Lệ, Nguyễn Hồng Lộc, Trần Quốc Dung (2006), Cơng nghệ gen trong
nông nghiệp, Đại học Nông Lâm - Đại học Huế.
8. Đoàn Thị Mai, Lê Sơn, Nguyễn Thị Thơm, Phan Quyền, (2003), Nghiên cứu chọn và nhân giống cho xoan ta và tếch có năng suất cao, Trung tâm Nghiên cứu giống cây rừng.
9. Nguyễn Văn Phong (2016), “Nghiên cứu hệ thống tái sinh cây xoan ta in vitro từ chồi cây xoan ta trội”, Tạp chí Nơng nghiệp và Phát triển nơng thơn tháng 11/2016, 58-64.
10. Nguyễn Đình Sâm (1995), Sinh lý thực vật, Nhà xuất bản Đại học Lâm nghiệp. 11. Bùi Phƣơng Thảo (2007), Nghiên cứu và hoàn thiện hệ thống tái sinh in vitro
cây bạch đàn (Eucalyptus) phục vụ chuyển gen, Khóa luận tốt nghiệp, Đại học
12. Bùi Văn Thắng, Đỗ Xuân Đồng, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà (2013), “Quy trình chuyển gen vào cây xoan ta (Melia azedazach L.) bằng Agrobacterium đạt hiệu suất cao”, Tạp chí sinh học, 35(2), 227-233.
Tài liệu Tiếng Anh
13. Bauer, D., Biehler K., et al. (1997), “A role for cytosolic glutamine synthetase in the remobilization of leaf nitrogen during water stress in tomato”,
Physiologia Plantarum, 99 (2), pp. 241-248.
14. Bernard, S.M. and Habash D.Z. (2009), “The importance of cytosolic glutamine synthetase in nitrogen assimilation and recycling”, New Phytologist, 182 (3), pp. 608-620.
15. Brugière, N., Dubois F., et al. (1999), “Glutamine synthetase in the phloem plays a major role in controlling proline production”, The Plant Cell, 11 (10), pp.
1995-2011.
16. Cren, M. and Hirel B. (1999), “Glutamine synthetase in higher plants regulation of gene and protein expression from the organ to the cell”, Plant and Cell
Physiology, 40 (12), pp. 1187-1193.
17. Davies, P.J. (1995), Plant hormones: physiology, biochemistry and molecular biology, Springer Science & Business Media.
18. Edwards, J.W., Walker E.L., and Coruzzi G.M. (1990), “Cell-specific expression in transgenic plants reveals nonoverlapping roles for chloroplast and cytosolic glutamine synthetase”, Proceedings of the National Academy of Sciences, 87 (9), pp. 3459-3463.
19. Fuentes, S.I., Allen D.J., Ortiz‐Lopez A., and Hernández G. (2001), “Over‐ expression of cytosolic glutamine synthetase increases photosynthesis and growth at low nitrogen concentrations”, Journal of Experimental Botany, 52 (358), pp. 1071- 1081.
20. Gallardo, F., Fu J., Cantón F.R., García-Gutiérrez A., Cánovas F.M., and Kirby E.G. (1999), “Expression of a conifer glutamine synthetase gene in transgenic poplar”, Planta, 210 (1), pp. 19-26.
21. Godfrey, R.K. (1988), Trees, shrubs, and woody vines of northern Florida and adjacent Georgia and Alabama, University of Georgia Press.
22. Hiei, Y., Ohta S., Komari T., and Kumashiro T. (1994), “Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T‐DNA”, The Plant Journal, 6 (2), pp. 271-282. 23. Hirel, B., Marsolier M.C., et al. (1992), “Forcing expression of a soybean root glutamine synthetase gene in tobacco leaves induces a native gene encoding cytosolic enzyme”, Plant molecular biology, 20 (2), pp. 207-218.
24. Huang, R.C., Tadera K., et al. (1996), “Limonoids from Melia azedarach”,
25. Indieka, S., Odee D., Muluvi G., Rao K., and Machuka J. (2007), “Regeneration of Melia volkensii Gürke (Meliaceae) through direct somatic embryogenesis”, New Forests, 34 (1), pp. 73-81.
26. Ishiyama, K., Inoue E., Watanabe-Takahashi A., Obara M., Yamaya T., and Takahashi H. (2004), “Kinetic properties and ammonium-dependent regulation of cytosolic isoenzymes of glutamine synthetase in Arabidopsis”, Journal of Biological Chemistry, 279 (16), pp. 16598-16605.
27. Kakkar, A. and Verma V.K. (2011), “Agrobacterium mediated biotransformation”, J Appl Pharm Sci, 1 (7), pp. 29-35.
28. Lea, P. and Miflin B. (1980), “Transport and metabolism of asparagine and other nitrogen compounds within the plant”, in Amino Acids and Derivatives,
Elsevier, pp. 569-607.
29. Man, S., Gao W., Wei C., and Liu C. (2012), “Anticancer drugs from traditional toxic Chinese medicines”, Phytotherapy Research, 26 (10), pp. 1449-
1465.
30. Miflin, B.J. and Habash D.Z. (2002), “The role of glutamine synthetase and glutamate dehydrogenase in nitrogen assimilation and possibilities for improvement in the nitrogen utilization of crops”, Journal of experimental botany, 53 (370), pp.
979-987.
31. Mroginski, L.A. and Rey H.Y. (2012), “Micropropagation of paradise tree (Melia azedarach) by in vitro culture of axillary buds”, in Protocols for Micropropagation of Selected Economically-Important Horticultural Plants,
Springer, pp. 223-230.
32. Nakanishi, H. (1996), “Fruit color and fruit size of bird-disseminated plants in Japan”, Vegetatio, 123 (2), pp. 207-218.
33. Nixon, E., Ward J., Fountain E., and Neck J. (1991), “Woody vegetation of