STT Thành phần Thể tích
(µl)
1 Gen Cystatin 10 đã đƣợc tinh
sạch 5,0 2 Buffer T4 ligase 1,0 3 Vector pBT 1,0 4 T4 ligase (2 unit/µl) 1,0 5 H2O 2,0 Tổng 10,0
Hỗn hợp đƣợc ủ ở nhiệt độ 22o C trong 1 giờ và sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến chủng E.coli DH5.
Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến chủng E.coli DH5
Biến nạp là quá trình chuyển DNA plasmid trực tiếp vào tế bào thể nhận. Cơ chế biến nạp là việc làm thay đổi thành phần cấu trúc thành tế bào của vi khuẩn để DNA plasmid dễ dàng vào tế bào thể nhận. Những tế bào có khả năng tiếp nhận DNA plasmid ngoại lai đƣợc gọi là tế bào khả biến. Quá trình biến nạp DNA vào tế bào E.coli đƣợc tiến hành nhƣ sau:
- Tế bào khả biến lấy trong tủ -800C. Sau đó để trên đá trong 10 phút. - Cho 10 µl vector tái tổ hợp vào ống chứa tế bào khả biến E.coli
DH5α, trộn nhẹ, đ t ổn định trên đá 10 phút.
- Sốc nhiệt ở 42oC trong 1 phút 30 giây, đ t trong đá 10 phút.
- Bổ sung 500 µl LB lỏng vào ống tế bào đã sốc nhiệt, sau đó đem đi nuôi phục hồi ở 37o
C trong 1h.
- Lấy ra cấy trải trên mơi trƣờng LB đ c có kháng sinh ampicilin (100 mg/l), IPTG (0,1 mM) và X - gal (40 mg/l). Chọn khuẩn lạc có màu trắng ni qua đêm trong mơi trƣờng LB lỏng (có bổ sung ampicilin 100 mg/l).
Kiểm tra sản phẩm chọn dòng
Để kiểm tra sản phẩm chọn dịng, chúng tơi tiến hành lấy 2 ml dịch nuôi chứa vi khuẩn E.coli đã đƣợc biến nạp đem đi li tâm, thu c n, bổ sung 20 µl H2O thu đƣợc tế bào E.coli có khả năng mang vector tái tổ hợp. Sau đó thực hiện phản ứng PCR với c p mồi đ c hiệu nhân gen.