3. Nội dung nghiên cứu
1.3.2. Cystati n chất ức chế Cysteine proteinase
Cystatin (CYS) là chất ức chế có bản chất là protein. Chúng có m t trong vi sinh vật, động vật và thực vật. Trong những năm gần đây bàn luận nhiều về mối liên quan giữa cystatin tới tính chống chịu yếu tố bất lợi của ngoại cảnh nhƣ : hạn, lạnh, muối, sự già và bảo vệ thực vật chống lại côn trùng, vi sinh vật gây bệnh và đ c biệt là tính kháng mọt. Protein này có mối quan hệ về m t cấu trúc và chức năng với chất ức chế của cysteine proteinase, nó đƣợc mô tả lần đầu tiên ở lòng trắng trứng gà và sau đó đƣợc gọi là cystatin lòng trắng trứng gà [20], [24].
Lƣợng cystatin có sự thay đổi theo bậc thang tiến hóa, thể hiện vai trò quan trọng trong sự thích nghi của thực vật, điều này đƣợc chứng minh qua việc nghiên cứu nguồn gốc và sự tiến hóa của các cystatin, papain và cystatin proteinase ở thực vật [22], [38].
Các cystatin kìm hãm hoạt động của cysteine protenase có liên hệ với
nhau về m t tiến hóa, hình thành nên siêu họ cystatin. Các thành viên của siêu họ này đƣợc phân chia thành ba nhóm có mối liên hệ ch t ch với nhau, sự phân loại đó dựa trên sự tƣơng đồng của trình tự bậc một, khối lƣợng phân tử, số lƣợng liên kết disulfide và sự định vị của chúng trong tế bào.
Cystatin họ 1, đƣợc biết là họ stefin, không chứa liên kết disulfide ho c
các nhóm carbohydrate, nó có trọng lƣợng phân tử khoảng 11 kDa, gồm 100 gốc amino acid.
Cystatin họ 2, là protein có 2 liên kết disulfide trong chuỗi ở gần đầu
carbon cuối cùng và đƣợc glycosyl hóa, có trọng lƣợng phân tử khoảng 13 - 24 kDa với 115 amino acid.
Cystatin họ 3, có tên là Kininogen, bao gồm các Kininogen huyết
tƣơng, nó lớn hơn các thành viên khác của hai họ kia và hầu hết các phức hợp phân tử cystatin có trọng lƣợng phân tử cao (60 - 120 kDa) với khoảng 355
gốc amino acid có chứa các liên kết disulfide. Các kininogen giữ vai trò quan trọng trong quá trình đông máu.
Ngoài ba họ trên, dựa vào sự khác nhau giữa cystatin phân lập từ động vật và thực vật, ngƣời ta còn bổ sung thêm họ phytocystatin [21], gồm hầu hết các chất ức chế cysteine proteinase của thực vật, chúng có tính chất chung với hầu hết các cystatin họ I và II. Trong họ phytocystatin thì oryzacystatin từ hạt gạo là chất ức chế nguồn gốc thực vật đầu tiên đƣợc nghiên cứu. Nó có mối liên hệ về m t cấu trúc và chức năng với cystatin lòng trắng trứng gà.
Oryzacystatin cũng đƣợc xếp vào cystatin nhóm I do sự vắng m t của liên kết disulfide, chuỗi pentapeptide cũng đƣợc tạo thành bởi Gln-Val-Val-Ala-Gly (gốc thứ 57 - 61) và khối lƣợng phân tử xấp xỉ 11,5 kDal với 102 gốc amino acid. Trình tự amino acid của oryzacystatin giống 30% với cystatin họ II, nó
có vùng trình tự Phe-Ala-Val (gốc thứ 29 - 31) và Phe - Try (gốc thứ 83 - 84), điều đó chứng tỏ oryzacysstatin cũng có thể xếp vào nhóm cystatin họ II.
Gen cystatin đƣợc phân lập đầu tiên từ mRNA của cây lúa, ký hiệu là OC1 có đoạn mã hóa dài 309 nucleotide, mã hóa phân tử protein dài 102
amino acid [18]. Ở cây đậu xanh, gen cystatin đƣợc Kang và cs phân lập, đọc trình tự từ mRNA và công bố tại ngân hàng gen Quốc tế có mã số D38130 với kích thƣớc 304 nucleotide, đoạn mã hóa gồm 267 nucleotide mã hóa 88 amino acid [50]. Cũng thuộc nhóm cây đậu đỗ, gen cystatin ở cây đậu tƣơng khá lớn, có kích thƣớc 5863 bp trên đó có 4 exon và 3 intron đƣợc Misaka phân lập năm 2000 [48]. Ở cây lạc, Vũ Thị Thu Thủy cũng đã phân lập đƣợc đoạn gen cystatin có chiều dài 461 bp với 2 exon và 1 intron; Protein do gen mã hóa có 98 amino acid [18]. So với gen cystatin phân lập từ DNA hệ gen,
Kết quả nghiên cứu ở ngô cho thấy, có 10 gen cystatin của ngô, các gen ký hiệu là CC gồm có CC1, CC2, CC3, CC4, CC5, CC6, CC7, CC8, CC9, và
CC10. Trong 10 gen cystatin ở ngô, có 9 gen đƣợc phân lập từ mRNA, chỉ có
gen CC1 phân lập từ DNA. Kích thƣớc gen CC1 chứa 2024bp, trong đó có 3
exon và 2 intron, 3 exon mã hóa phân tử protein dài 134 amino acid. Sự biểu hiện của gen cystatin là khác nhau ở các thời kỳ phát triển khác nhau của cây ngô. Trong 10 gen cystatin ở ngô, CC1 ƣu tiên biểu hiện trong cờ non, hai gen
CC8, CC10 biểu hiện trong việc phát triển hạt, 7 gen CC còn lại biểu hiện
trong hai ho c nhiều mô khác nhau. Riêng trong điều kiện chịu ảnh hƣởng của sự thiếu hụt nƣớc có tới 5 gen cùng biểu hiện, đó là các gen CC2, CC3, CC4,
CC5 và CC9 [34].
Gen cystatin đã đƣợc nghiên cứu và phân lập ở táo [40], lúa [27], cà rốt [37], đậu tƣơng [28], khoai tây [44], đậu đũa [30] và ngô [17], [23].
Nghiên cứu về tác động của chất ức chế proteinase lên sinh lý tiêu hóa của côn trùng là một lĩnh vực quan trọng và đã thu đƣợc những kết quả đáng kể trong công tác kiểm soát sinh học đối với côn trùng có hại. Nhiều nghiên cứu về tƣơng tác của chất ức chế proteinase lên chế độ ăn của côn trùng đã đƣợc phát triển trong một thời gian dài. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng, khi có m t các chất ức chế này trong thức ăn của côn trùng có hại s làm tăng tỷ lệ tử vong. Soyacystatin (scN) có khả năng ức chế sự sinh trƣởng của mọt đậu đũa (C. maculatus) thế hệ I và II [32]. Oryzacystatin – I dạng dại và dạng đột biến (có tên là OC – Idelta D86 – bị loại bỏ gốc Asp86) đều biểu hiện tác động xấu lên sự sinh trƣờng và phát triển của Globodera pallida (một loại giun tròn ký sinh thực vật).
Vì vậy, một hƣớng nghiên cứu mới với những ứng dụng thực tiễn trong việc tạo ra thực vật chuyển gen ức chế proteinase nhờ công nghệ DNA tái tổ hợp để nâng cao khả năng kháng mọt của cây trồng [45].
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU
- Sử dụng 6 giống ngô để làm vật liệu nghiên cứu: HG (Hà Giang) – Trạm
khuyễn nông TP. Hà Giang; CB (Cao Bằng) - Trạm Khuyến nông – Khuyến lâm
thành phố Cao Bằng; BK (Bắc Kạn) – Trạm khuyến nông huyện Ba Bể; TQ
(Tuyên Quang) – Trạm khuyến nông Hàm Yên; TN (Thái Nguyên) – Trạm khuyến
nông TP. Thái Nguyên; BG (Bắc Giang) – Trạm khuyến nông huyện Tân Yên.
2.2. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
2.2.1. Hóa chất
Sử dụng các loại hóa chất tinh khiết và chuyên dụng có nguồn gốc từ các hãng nổi tiếng trên thế giới (hãng Invitrogen, Fermentas), bao gồm: Enzyme Taq-polymerase, buffer PCR, SDS, EDTA, Tris, agarose…
2.2.2. Thiết bị
Thiết bị sử dụng là các thiết bị hiện đại của các hãng nổi tiếng đƣợc trang bị tại các phòng thí nghiệm, đảm bảo độ chính xác cho kết quả của thí nghiệm.
Các thiết bị sử dụng gồm có:
+ Box cấy vô trùng Nuaire (Mỹ) + Máy PCR (Mỹ)
+ Bộ điện di (Mỹ) + Máy đo pH 151 Martini (Nhật) + Bể ổn nhiệt (Mỹ) + Máy ly tâm lạnh Hettich (Đức) + Máy lắc (Hàn Quốc) + Tủ lạnh sâu -80o
C, -20o C (Italy) + Máy đo quang phổ (Đức) + Tủ ấm, tủ sấy Memmert (Đức) + Máy soi gel (Mỹ) + Nồi khử trùng (Đài Loan) + Cân kĩ thuật (Đức) + Máy vortex (Mỹ)
Ngoài các thiết bị trên còn cần một số đồ dụng thiết bị cần thiết khác phục vụ cho nghiên cứu.
2.2.3. Địa điểm nghiên cứu
Các thí nghiệm đƣợc tiến hành tại phòng Công nghệ DNA và ứng dụng Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, phòng thí nghiệm Sinh học Trƣờng Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên.
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phương pháp sinh lí
Để đánh giá nhanh khả năng kháng mọt của 06 giống ngô địa phƣơng, chúng tôi đã thực hiện phƣơng pháp đánh giá tổn thất thức ăn theo tác giả Hà Quang Hùng [9].
Tính lƣợng thức ăn hao hụt sau một thời gian theo dõi đối với loài mọt ngô Sitophilus zeamais bằng cách bố trí 2 lô theo dõi: lô thí nghiệm (thả mọt) nhắc lại 3 lần và lô đối chứng (không thả mọt). Cân 50 g ngô cho vào một lọ nhựa, mỗi lọ nhựa thả 15 c p mọt trƣởng thành. Ðộ hao hụt do mọt tiêu hao đƣợc theo dõi sau 10 ngày, 20 ngày, 30 ngày, 40 ngày, 50 ngày, 60 ngày.
Trọng lƣợng thức ăn hao hụt đƣợc tính theo công thức: P = 50 – Pt – P0 (g)
Trong đó:
P: trọng lƣợng thức ăn hao hụt ở công thức thí nghiệm
Pt: trọng lƣợng thức ăn cân đƣợc sau một thời gian bảo quản P0: trọng lƣợng thức ăn hao hụt ở công thức đối chứng 50 g: trọng lƣợng thức ăn đƣa vào thí nghiệm
2.3.2. Phương pháp sinh học phân tử
2.3.2.1. Phương pháp tách chiết RNA tổng số
Chúng tôi tiến hành tách chiết RNA tổng số bằng Trizol Reagent Kit Quy trình tách chiết RNA tổng số:
- Nghiền mẫu bằng nitơ lỏng (100 mg lá ngô non). Bột đã nghiền cho vào ống eppendorf 2 ml
- Bổ sung 1ml Trizol để 3 phút ủ đá.
- Bổ sung 0,2 ml Chloroform vào ống, lắc mạnh trong 15 giây, để 3 phút ủ đá. Ly tâm 8000 vòng/phút trong 15 phút ở 4o
C.
- Hút 400 µl chuyển sang ống Eppendorf 1,5 ml. Bổ sung 0,5 ml isopropanol, ủ ở - 20o
C trong 30 phút.
- Ly tâm 12000 vòng/ phút trong 15 phút ở 4oC, thu tủa
- Rửa tủa với cồn 70% DEPC. Ly tâm 12000 vòng/ phút trong vòng 10 phút. Sấy khô mẫu.
- Bổ sung 30 µl DEPC – H2O.
- Sử dụng 1µl để định lƣợng RNA tổng số bằng máy Nano drop.
2.3.2.2. Định lượng và kiểm tra độ tinh sạch của RNA tổng số
Kiểm tra độ tinh sạch của RNA bằng 2 phƣơng pháp: (1) Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ
Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của RNA trên máy quang phổ ở bƣớc sóng λ = 260 nm và λ = 280 nm. Hàm lƣợng và độ sạch của nucleic acid trong dung dịch tách chiết đƣợc tính theo công thức:
Hàm lƣợng RNA (ng/μl) = OD260×40× hệ số pha loãng. Độ sạch RNA = OD260/OD280.
Trong đó:
OD260: chỉ số đo đƣợc ở bƣớc sóng 260 nm OD280: chỉ số đo đƣợc ở bƣớc sóng 280 nm
Nếu độ sạch RNA = 1,8 - 2,0 thì mẫu đƣợc coi là sạch. (2) Phƣơng pháp điện di
Điện di RNA bằng bộ điện di, chạy điện di ở điện thế 110V với gel agarose 0,8% trong dung dịch TAE 1X. Sản phẩm điện di đƣợc nhuộm bằng ethidium bromide, sau đó đƣợc soi dƣới ánh đèn UV và chụp ảnh.
Dựa vào hình ảnh điện di kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của RNA trong mẫu thí nghiệm đã tách chiết.
2.3.2.3. Phương pháp tổng hợp cDNA
Tổng hợp cDNA từ mRNA theo bộ kit ReverdAid First Stand cDNA Synthesis (Thermo Scientific).
Bảng 2.1. Thành phần của phản ứng tổng hợp cDNA
STT Thành phần Thể tích (µl)
1 Mồi OligoT 1
2 RNA khuôn 6
3 H2O (DEPC) 5
Mix nhẹ, ủ ở 650C trong 5 phút, sau đó cho ngay vào đá.
Tiếp theo bổ sung thêm các thành phần sau:
4 5X Reaction Buffer 4
5 RiboLock RNase Inhibitor (20 U/µl) 1
6 dNTP 10 Mm 2
7 RevertAid H Minus Transcriptase (200 U/µl) 1
Tổng thể tích 20 Ủ 25O C trong 5 phút - 42OC trong 60 phút – 70OC trong 5 phút. Bƣớc cuối ủ 4O C.
Điện di sản phẩm trên gel agarose 0,8% trong đệm TAE 1X. Sau đó nhuộm gel trong ethidium bromide 1% và chụp ảnh dƣới ánh đèn tử ngoại.
2.3.2.4. Kỹ thuật PCR
Sau khi tổng hợp xong cDNA, tiến hành khuếch đại sản phẩm gen phục vụ cho bƣớc gắn gen vào vector tách dòng pBT theo phƣơng pháp của Sambrook và cs (2001) [41].
Chúng tôi sử dụng c p mồi đ c hiệu dùng cho phản ứng gồm mồi xuôi và mồi ngƣợc có trình tự nhƣ sau:
Bảng 2.2. C p mồi nhân gen Cystatin 10
Mồi Trình tự mồi (5’ – 3’) Nhiệt ộ
gắn mồi
CYS10-F CGT CGA CGA TGG CTC GTG GGC TCG GCG CTT 580C
CYS10-R CAA GCT TGT TAC TTG GCG GCC GCC GGC GCG 580C
Thực hiện phản ứng PCR nhân gen Cystatin 10 với chu trình nhiệt:
- Thành phần phản ứng RT-PCR nhân gen Cystatin10 ở ngô đƣợc trình
bày ở bảng 2.3.
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng RT-PCR nhân gen Cystatin 10
STT Thành phần Thể tích (μl) 1 PCR Master Mix 12,5 µl 2 cDNA (50ng/µl) 1 µl 3 Mồi xuôi (10pM/µl) 1 µl 4 Mồi ngƣợc (10pM/µl) 1 µl 5 H2O 9,5 µl Tổng 25 µl ∞ 4 phút 30 giây 94oC 94oC 7 phút 45 giây 72oC 72oC 30 giây 58oC 4oC 35 chu kỳ
Sau khi thu đƣợc sản phẩm nhân gen, chúng tôi tiến hành kiểm trên gel agarose 1%, nhuộm bản gel trong ethidium bromide. Sau đó chụp ảnh dƣới ánh sáng của đèn cực tím.
2.3.2.5. Làm sạch sản phẩm PCR
Sau khi nhân đƣợc gen, bƣớc tiếp theo là cần thu nhận gen ở dạng sạch và không lẫn gel agarose để sử dụng cho công việc tạo dòng. Vì vậy, chúng tôi tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR theo bộ kít GeneJET Gel Extraction Kit của hãng Thermo. Các bƣớc tiến hành nhƣ sau:
- Điện di sản phẩm PCR (một giếng sản phẩm, một giếng marker).
- Cắt giếng marker và giếng đối chứng nhuộm trong ethidium bromide 10phút và soi dƣới ánh đèn cực tím.
- Cắt gel có sản phẩm cho vào ống Eppendorf 1,5 ml. - Cân gel theo quy ƣớc 1 mg tƣơng đƣơng 3µl.
- Bổ sung dịch bám (binding solution) theo tỷ lệ 1: 1.
- Ủ ở nhiệt độ 50 - 600C trong 15 phút, trộn nhẹ cho gel tan hoàntoàn. - Chuyển hỗn hợp lên cột thôi gel, ly tâm 12000 vòng/ phút, 1 phút, bỏ dịch.
- Bổ sung 700µl dung dịch rửa (wash solution) vào cột, ly tâm 12000 vòng/ phút, 1 phút, bỏ dịch.
- Ly tâm cột tiếp 12000 vòng/ phút,1 phút. Để ở nhiệt độ phòng 5 phút. - Hòa tan trong 30µl nƣớc khử ion, đ t cột sang ống Eppendoft mới. - Ly tâm 12000 vòng/ phút, 3 phút. Thu dịch, loại bỏ cột.
- Sản phẩm đƣợc giữ ở -20oC.
2.3.2.6.. Tách dòng gen
Tạo plasmid tái tổ hợp
Sản phẩm PCR đã làm sạch đƣợc gắn trực tiếp vào vector tách dòng pBT với thành phần phản ứng trong bảng 2.4.
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng gắn gen Cystatin 10 vào vector PBT
STT Thành phần Thể tích
(µl)
1 Gen Cystatin 10 đã đƣợc tinh
sạch 5,0 2 Buffer T4 ligase 1,0 3 Vector pBT 1,0 4 T4 ligase (2 unit/µl) 1,0 5 H2O 2,0 Tổng 10,0
Hỗn hợp đƣợc ủ ở nhiệt độ 22o C trong 1 giờ và sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến chủng E.coli DH5.
Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến chủng E.coli DH5
Biến nạp là quá trình chuyển DNA plasmid trực tiếp vào tế bào thể nhận. Cơ chế biến nạp là việc làm thay đổi thành phần cấu trúc thành tế bào của vi khuẩn để DNA plasmid dễ dàng vào tế bào thể nhận. Những tế bào có khả năng tiếp nhận DNA plasmid ngoại lai đƣợc gọi là tế bào khả biến. Quá trình biến nạp DNA vào tế bào E.coli đƣợc tiến hành nhƣ sau:
- Tế bào khả biến lấy trong tủ -800C. Sau đó để trên đá trong 10 phút. - Cho 10 µl vector tái tổ hợp vào ống chứa tế bào khả biến E.coli
DH5α, trộn nhẹ, đ t ổn định trên đá 10 phút.
- Sốc nhiệt ở 42oC trong 1 phút 30 giây, đ t trong đá 10 phút.
- Bổ sung 500 µl LB lỏng vào ống tế bào đã sốc nhiệt, sau đó đem đi nuôi phục hồi ở 37o
C trong 1h.
- Lấy ra cấy trải trên môi trƣờng LB đ c có kháng sinh ampicilin (100 mg/l), IPTG (0,1 mM) và X - gal (40 mg/l). Chọn khuẩn lạc có màu trắng nuôi qua đêm trong môi trƣờng LB lỏng (có bổ sung ampicilin 100 mg/l).
Kiểm tra sản phẩm chọn dòng
Để kiểm tra sản phẩm chọn dòng, chúng tôi tiến hành lấy 2 ml dịch nuôi chứa vi khuẩn E.coli đã đƣợc biến nạp đem đi li tâm, thu c n, bổ sung 20 µl H2O thu đƣợc tế bào E.coli có khả năng mang vector tái tổ hợp. Sau đó thực hiện phản ứng PCR với c p mồi đ c hiệu nhân gen.
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng colony – PCR Thành phần Thể tích (µl) PCR Mastermix 2X 7,5 TB E.coli đã đƣợc biến nạp 5 Cystatin F (10pM/µl) 0,5 Cystatin R (10pM/µl) 0,5 H2O 1,5 Tổng 15
Chu kỳ nhiệt của phản ứng colony – PCR trình bày ở bảng 2.6.
Bảng 2.6. Chu kỳ nhiệt của phản ứng colony – PCR Bước Phản ứng Nhiệt ộ (0
C) Thời gian Chu kỳ