3. Nội dung nghiên cứu
2.2.3. Địa điểm nghiên cứu
Các thí nghiệm đƣợc tiến hành tại phòng Công nghệ DNA và ứng dụng Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, phòng thí nghiệm Sinh học Trƣờng Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên.
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phương pháp sinh lí
Để đánh giá nhanh khả năng kháng mọt của 06 giống ngô địa phƣơng, chúng tôi đã thực hiện phƣơng pháp đánh giá tổn thất thức ăn theo tác giả Hà Quang Hùng [9].
Tính lƣợng thức ăn hao hụt sau một thời gian theo dõi đối với loài mọt ngô Sitophilus zeamais bằng cách bố trí 2 lô theo dõi: lô thí nghiệm (thả mọt) nhắc lại 3 lần và lô đối chứng (không thả mọt). Cân 50 g ngô cho vào một lọ nhựa, mỗi lọ nhựa thả 15 c p mọt trƣởng thành. Ðộ hao hụt do mọt tiêu hao đƣợc theo dõi sau 10 ngày, 20 ngày, 30 ngày, 40 ngày, 50 ngày, 60 ngày.
Trọng lƣợng thức ăn hao hụt đƣợc tính theo công thức: P = 50 – Pt – P0 (g)
Trong đó:
P: trọng lƣợng thức ăn hao hụt ở công thức thí nghiệm
Pt: trọng lƣợng thức ăn cân đƣợc sau một thời gian bảo quản P0: trọng lƣợng thức ăn hao hụt ở công thức đối chứng 50 g: trọng lƣợng thức ăn đƣa vào thí nghiệm
2.3.2. Phương pháp sinh học phân tử
2.3.2.1. Phương pháp tách chiết RNA tổng số
Chúng tôi tiến hành tách chiết RNA tổng số bằng Trizol Reagent Kit Quy trình tách chiết RNA tổng số:
- Nghiền mẫu bằng nitơ lỏng (100 mg lá ngô non). Bột đã nghiền cho vào ống eppendorf 2 ml
- Bổ sung 1ml Trizol để 3 phút ủ đá.
- Bổ sung 0,2 ml Chloroform vào ống, lắc mạnh trong 15 giây, để 3 phút ủ đá. Ly tâm 8000 vòng/phút trong 15 phút ở 4o
C.
- Hút 400 µl chuyển sang ống Eppendorf 1,5 ml. Bổ sung 0,5 ml isopropanol, ủ ở - 20o
C trong 30 phút.
- Ly tâm 12000 vòng/ phút trong 15 phút ở 4oC, thu tủa
- Rửa tủa với cồn 70% DEPC. Ly tâm 12000 vòng/ phút trong vòng 10 phút. Sấy khô mẫu.
- Bổ sung 30 µl DEPC – H2O.
- Sử dụng 1µl để định lƣợng RNA tổng số bằng máy Nano drop.
2.3.2.2. Định lượng và kiểm tra độ tinh sạch của RNA tổng số
Kiểm tra độ tinh sạch của RNA bằng 2 phƣơng pháp: (1) Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ
Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của RNA trên máy quang phổ ở bƣớc sóng λ = 260 nm và λ = 280 nm. Hàm lƣợng và độ sạch của nucleic acid trong dung dịch tách chiết đƣợc tính theo công thức:
Hàm lƣợng RNA (ng/μl) = OD260×40× hệ số pha loãng. Độ sạch RNA = OD260/OD280.
Trong đó:
OD260: chỉ số đo đƣợc ở bƣớc sóng 260 nm OD280: chỉ số đo đƣợc ở bƣớc sóng 280 nm
Nếu độ sạch RNA = 1,8 - 2,0 thì mẫu đƣợc coi là sạch. (2) Phƣơng pháp điện di
Điện di RNA bằng bộ điện di, chạy điện di ở điện thế 110V với gel agarose 0,8% trong dung dịch TAE 1X. Sản phẩm điện di đƣợc nhuộm bằng ethidium bromide, sau đó đƣợc soi dƣới ánh đèn UV và chụp ảnh.
Dựa vào hình ảnh điện di kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của RNA trong mẫu thí nghiệm đã tách chiết.
2.3.2.3. Phương pháp tổng hợp cDNA
Tổng hợp cDNA từ mRNA theo bộ kit ReverdAid First Stand cDNA Synthesis (Thermo Scientific).
Bảng 2.1. Thành phần của phản ứng tổng hợp cDNA
STT Thành phần Thể tích (µl)
1 Mồi OligoT 1
2 RNA khuôn 6
3 H2O (DEPC) 5
Mix nhẹ, ủ ở 650C trong 5 phút, sau đó cho ngay vào đá.
Tiếp theo bổ sung thêm các thành phần sau:
4 5X Reaction Buffer 4
5 RiboLock RNase Inhibitor (20 U/µl) 1
6 dNTP 10 Mm 2
7 RevertAid H Minus Transcriptase (200 U/µl) 1
Tổng thể tích 20 Ủ 25O C trong 5 phút - 42OC trong 60 phút – 70OC trong 5 phút. Bƣớc cuối ủ 4O C.
Điện di sản phẩm trên gel agarose 0,8% trong đệm TAE 1X. Sau đó nhuộm gel trong ethidium bromide 1% và chụp ảnh dƣới ánh đèn tử ngoại.
2.3.2.4. Kỹ thuật PCR
Sau khi tổng hợp xong cDNA, tiến hành khuếch đại sản phẩm gen phục vụ cho bƣớc gắn gen vào vector tách dòng pBT theo phƣơng pháp của Sambrook và cs (2001) [41].
Chúng tôi sử dụng c p mồi đ c hiệu dùng cho phản ứng gồm mồi xuôi và mồi ngƣợc có trình tự nhƣ sau:
Bảng 2.2. C p mồi nhân gen Cystatin 10
Mồi Trình tự mồi (5’ – 3’) Nhiệt ộ
gắn mồi
CYS10-F CGT CGA CGA TGG CTC GTG GGC TCG GCG CTT 580C
CYS10-R CAA GCT TGT TAC TTG GCG GCC GCC GGC GCG 580C
Thực hiện phản ứng PCR nhân gen Cystatin 10 với chu trình nhiệt:
- Thành phần phản ứng RT-PCR nhân gen Cystatin10 ở ngô đƣợc trình
bày ở bảng 2.3.
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng RT-PCR nhân gen Cystatin 10
STT Thành phần Thể tích (μl) 1 PCR Master Mix 12,5 µl 2 cDNA (50ng/µl) 1 µl 3 Mồi xuôi (10pM/µl) 1 µl 4 Mồi ngƣợc (10pM/µl) 1 µl 5 H2O 9,5 µl Tổng 25 µl ∞ 4 phút 30 giây 94oC 94oC 7 phút 45 giây 72oC 72oC 30 giây 58oC 4oC 35 chu kỳ
Sau khi thu đƣợc sản phẩm nhân gen, chúng tôi tiến hành kiểm trên gel agarose 1%, nhuộm bản gel trong ethidium bromide. Sau đó chụp ảnh dƣới ánh sáng của đèn cực tím.
2.3.2.5. Làm sạch sản phẩm PCR
Sau khi nhân đƣợc gen, bƣớc tiếp theo là cần thu nhận gen ở dạng sạch và không lẫn gel agarose để sử dụng cho công việc tạo dòng. Vì vậy, chúng tôi tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR theo bộ kít GeneJET Gel Extraction Kit của hãng Thermo. Các bƣớc tiến hành nhƣ sau:
- Điện di sản phẩm PCR (một giếng sản phẩm, một giếng marker).
- Cắt giếng marker và giếng đối chứng nhuộm trong ethidium bromide 10phút và soi dƣới ánh đèn cực tím.
- Cắt gel có sản phẩm cho vào ống Eppendorf 1,5 ml. - Cân gel theo quy ƣớc 1 mg tƣơng đƣơng 3µl.
- Bổ sung dịch bám (binding solution) theo tỷ lệ 1: 1.
- Ủ ở nhiệt độ 50 - 600C trong 15 phút, trộn nhẹ cho gel tan hoàntoàn. - Chuyển hỗn hợp lên cột thôi gel, ly tâm 12000 vòng/ phút, 1 phút, bỏ dịch.
- Bổ sung 700µl dung dịch rửa (wash solution) vào cột, ly tâm 12000 vòng/ phút, 1 phút, bỏ dịch.
- Ly tâm cột tiếp 12000 vòng/ phút,1 phút. Để ở nhiệt độ phòng 5 phút. - Hòa tan trong 30µl nƣớc khử ion, đ t cột sang ống Eppendoft mới. - Ly tâm 12000 vòng/ phút, 3 phút. Thu dịch, loại bỏ cột.
- Sản phẩm đƣợc giữ ở -20oC.
2.3.2.6.. Tách dòng gen
Tạo plasmid tái tổ hợp
Sản phẩm PCR đã làm sạch đƣợc gắn trực tiếp vào vector tách dòng pBT với thành phần phản ứng trong bảng 2.4.
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng gắn gen Cystatin 10 vào vector PBT
STT Thành phần Thể tích
(µl)
1 Gen Cystatin 10 đã đƣợc tinh
sạch 5,0 2 Buffer T4 ligase 1,0 3 Vector pBT 1,0 4 T4 ligase (2 unit/µl) 1,0 5 H2O 2,0 Tổng 10,0
Hỗn hợp đƣợc ủ ở nhiệt độ 22o C trong 1 giờ và sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến chủng E.coli DH5.
Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến chủng E.coli DH5
Biến nạp là quá trình chuyển DNA plasmid trực tiếp vào tế bào thể nhận. Cơ chế biến nạp là việc làm thay đổi thành phần cấu trúc thành tế bào của vi khuẩn để DNA plasmid dễ dàng vào tế bào thể nhận. Những tế bào có khả năng tiếp nhận DNA plasmid ngoại lai đƣợc gọi là tế bào khả biến. Quá trình biến nạp DNA vào tế bào E.coli đƣợc tiến hành nhƣ sau:
- Tế bào khả biến lấy trong tủ -800C. Sau đó để trên đá trong 10 phút. - Cho 10 µl vector tái tổ hợp vào ống chứa tế bào khả biến E.coli
DH5α, trộn nhẹ, đ t ổn định trên đá 10 phút.
- Sốc nhiệt ở 42oC trong 1 phút 30 giây, đ t trong đá 10 phút.
- Bổ sung 500 µl LB lỏng vào ống tế bào đã sốc nhiệt, sau đó đem đi nuôi phục hồi ở 37o
C trong 1h.
- Lấy ra cấy trải trên môi trƣờng LB đ c có kháng sinh ampicilin (100 mg/l), IPTG (0,1 mM) và X - gal (40 mg/l). Chọn khuẩn lạc có màu trắng nuôi qua đêm trong môi trƣờng LB lỏng (có bổ sung ampicilin 100 mg/l).
Kiểm tra sản phẩm chọn dòng
Để kiểm tra sản phẩm chọn dòng, chúng tôi tiến hành lấy 2 ml dịch nuôi chứa vi khuẩn E.coli đã đƣợc biến nạp đem đi li tâm, thu c n, bổ sung 20 µl H2O thu đƣợc tế bào E.coli có khả năng mang vector tái tổ hợp. Sau đó thực hiện phản ứng PCR với c p mồi đ c hiệu nhân gen.
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng colony – PCR Thành phần Thể tích (µl) PCR Mastermix 2X 7,5 TB E.coli đã đƣợc biến nạp 5 Cystatin F (10pM/µl) 0,5 Cystatin R (10pM/µl) 0,5 H2O 1,5 Tổng 15
Chu kỳ nhiệt của phản ứng colony – PCR trình bày ở bảng 2.6.
Bảng 2.6. Chu kỳ nhiệt của phản ứng colony – PCR Bước Phản ứng Nhiệt ộ (0
C) Thời gian Chu kỳ
1 Biến tính 94 4 phút 1
2 Biến tính 94 30 giây
30
3 Gắn mồi 58 30 giây
4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút
5 Hoàn tất kéo dài 72 7 phút 1
6 Kết thúc phản ứng 4 ∞
Sản phẩm PCR chọn dòng đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X. Sau đó nhuộm gel trong ethidium bromide và chụp ảnh dƣới ánh sáng đèn cực tím.
2.3.2.7. Tách plasmid tái tổ hợp
- Giữ chủng vi khuẩn : Cho 300 µl glycerol 100% và 700 µl khuẩn
cho vào nito lỏng. Sau đó đƣa vào tủ -80oC để bảo quản. Nếu giữ ở tủ -20o
C, lấy 500 µl khuẩn và 500 µl glycerol 50%.
- Tách plasmid:
A. Chuẩn bị
1. Sol I: 50 mM glucose; 25 mM Tris-HCl pH=8,0; 10 mM EDTA pH=8,0
2. Sol II: 0,2N NaOH; 1% SDS (phá vỡ màng tế bào)
3. Sol III: 60 ml CH3COOK 5M; 11,5 ml acetic acid; 28,5 ml H2O 4. Dung dịch: Phenol: Chloroform(1:1)
5. Lysozyme : 20 mg/ml
Các dung dịch pha ở trên đƣợc bảo quản trong tủ lạnh (trừ dung dịch SolII) B. Quy trình
1. Hút 2 ml dịch khuẩn cho vào Eppendorf, ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút, 40C.
2. Bỏ dịch nổi, thu sinh khối c n
3. Bổ sung 200 µl Sol I, vortex cho tan đều.
4. Bổ sung 10 µl lysozyme 20 mg/ml, đảo nhẹ, để lắng trong đá 10 phút. 5. Bổ sung 400 µl Sol II lắc nhẹ nhàng 5 lần cho tan đều đ t ngay trong đá. 6. Bổ sung 300 µl Sol III đảo nhẹ vài lần để trong đá lạnh (3-5 phút). 7. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C. Hút dịch nổi (pha trên) cho vào ống Eppendorf mới.
8. Thêm chloroform: Isoamyl (24:1) theo tỉ lệ 1:1 (v/v) vortex đều, ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4o
C. Hút dịch pha trên cho vào ống Eppendorf mới.
9. Bổ sung Isopropanol theo tỉ lệ 1:1 để trong tủ -20o
C trong 30 phút. 10. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút, 40C, loại dịch thu c n.
12. Thêm 1 ml cồn 70% để rửa. Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, 40
C. 13. Bỏ dịch, thu c n, làm khô.
14. Hòa tan c n trong 30 µl nƣớc chứa RNase. 15. Giữ trong tủ -20oC để bảo quản.
2.3.3. Phương pháp xác định trình t nucleotide
Trình tự của gen Cystatin10 đƣợc xác định trên máy đọc trình tự nucleotide tự động tại Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.3.4. Phương pháp xử lí trình t gen
Sử dụng phần mềm BioEdit, BLAST để phân tích, so sánh.
2.3.5. Phương pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu
Sử dụng phƣơng pháp thống kê bằng phần mềm Microsoft Office Excel [12].
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG MỌT CỦA CÁC GIỐNG NGÔ BẰNG NHIỄM MỌT NHÂN TẠO CÁC GIỐNG NGÔ BẰNG NHIỄM MỌT NHÂN TẠO
Mọt thƣờng tấn công vào phôi trƣớc, sau đó đến nội nhũ và các bộ phận khác làm cho hạt chỉ còn lại một lớp vỏ mỏng. Thời gian phá hoại của mọt trong chu kỳ sinh trƣởng tƣơng đối dài. Năng suất, chất lƣợng ngô bị ảnh hƣởng nhiều khi bị mọt tấn công. Để đánh giá khả năng kháng mọt của các mẫu ngô nghiên cứu, chúng tôi dựa vào việc tính toán lƣợng thức ăn hao hụt sau một thời gian theo dõi (10 – 20 – 30 – 40 – 50 – 60 ngày) đối với loài mọt ngô Sitophilus zeamais. Mỗi lọ thí nghiệm chứa 50 g ngô hạt sau đó tiến hành gây mọt nhân tạo mỗi lọ thí nghiệm cho vào 15 c p mọt trƣởng thành. Kết quả số liệu đánh giá kháng mọt đƣợc trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Lƣợng ngô hao hụt theo thời gian của 6 giống ngô nghiên cứu
(Đơn vị: gam)
Ngày
Mẫu 10 ngày 20 ngày 30 ngày 40 ngày 50 ngày 60 ngày
Trung bình HG 0,22 ± 0,04 1,14 ± 0,12 1,91 ± 0,13 2,73 ± 0,21 3,40 ± 0,29 4,14 ± 0,41 2,26 CB 0,39 ± 0,13 1,56 ± 0,26 2,90 ± 0,30 4,23 ± 0,37 5,45 ± 0,63 6,99 ± 0,37 3,59 BK 0,94 ± 0,14 2,10 ± 0,24 3,23 ± 0,29 4,41 ± 0,27 5,59 ± 0,43 6,89 ± 0,52 3,86 TQ 1,52 ± 0,34 3,06 ± 0,32 4,70 ± 0,48 6,42 ± 0,66 8,00 ± 0,68 9,69 ± 0,73 5,57 TN 3,04 ± 0,11 5,95 ± 0,11 9,04 ± 0,09 12,15 ± 0,11 15,03 ± 0,27 18,01 ± 0,44 10,54 BG 3,77 ± 0,36 7,41 ± 0,52 10,92 ± 0,67 14,51 ±0,86 18,02 ± 0,85 21,51 ± 0,76 12,69 Trung bình 1,65 3,54 5,45 7,41 9,25 11,20
Kết quả thể hiện ở bảng 3.1 cho ta thấy sau 10 – 20 – 30 – 40 – 50 – 60 ngày, tất cả các giống ngô nghiên cứu đều bị mọt xâm hại, mức độ thức ăn hao hụt tăng theo thời gian: Sau 10 ngày, lƣơng ngô hao hụt trung bình ở các giống ngô nghiên cứu là 1,65 g; sau 20 ngày là 3,54 g; sau 30 ngày là 5,45 g;
sau 40 ngày là 7,41 g; sau 50 ngày là 9,25 g, sau 60 ngày 11,20 g. Ở ngày thứ 60 trọng lƣợng hao hụt của giống ngô BG là cao nhất (21,51 g) và thấp nhất là giống ngô HG (4,14 g).
Để kiểm tra xem lƣợng ngô hao hụt ở các mẫu thí nghiệm trên có thực sự khác nhau hay không, chúng tôi thực hiện phƣơng pháp so sánh nhiều mẫu độc lập theo tiêu chuẩn phi tham số của Kruskal và Wallis [12], kết quả tính đƣợc giá trị H = 17,16 > X5(0,005) = 16,75. Do đó có thể kết luận: Lƣợng thức ăn hao hụt ở các mẫu thí nghiệm thực sự khác nhau ở mức tin cậy 99,5%.
Hình 3.1. Biểu đồ biểu diễn lƣợng thức ăn hao hụt theo thời gian
ở các mẫu ngô nghiên cứu
Kết quả thể hiện ở hình 3.1 cho ta thấy lƣợng ngô hao hụt do mọt ăn tăng dần theo thời gian. Lƣợng hao hụt càng cao chứng tỏ khả năng kháng mọt của mẫu ngô kém và ngƣợc lại. Dựa vào số liệu và biểu đồ trên, có thể nhận thấy mẫu ngô HG là giống kháng mọt tốt nhất (lƣợng thức ăn hao hụt trung bình là 2,26 g) và mẫu ngô BG là giống kháng mọt kém nhất (lƣợng
thức ăn hao hụt trung bình là 12,69 g). Chúng tôi lựa chọn hai mẫu này để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
3.2. KẾT QUẢ PHÂN LẬP GEN CYSTATIN 10
3.2.1. Kết quả tách chiết RNA tổng số
Chúng tôi sử dụng lá non 7 ngày tuổi của 2 mẫu ngô BG và HG để tách chiết RNA tổng số. Sau khi tách chiết, chúng tôi kiểm tra chất lƣợng RNA tổng số bằng cách đo trên máy quang phổ NanoDrop, kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Giá trị tỉ lệ phổ hấp thụ A260/A280 và hàm lƣợng RNA của giống
ngô nghiên cứu
TT Giống A260/A280 Hàm lượng RNA (ng/µl)
1 HG 1,92 500
2 BG 1,96 786
3.2.2. Kết quả tổng hợp cDNA và nhân gen
Để tiến hành nhân gen Cystatin 10 của mẫu ngô kháng mọt tốt bằng
phƣơng pháp RT-PCR, chúng tôi đã dựa vào trình tự gen Cystatin 10 đƣợc phân lập từ ngô có mã số BN000514 đƣợc công bố trên Ngân hàng gen NCBI để thiết kế c p mồi đ c hiệu. Thành phần phản ứng đƣợc thể hiện ở bảng 2.1.
Trong quá trình thực hiện, chúng tôi nhận thấy rằng phản ứng PCR xảy