(Đơn vị: gam)
Ngày
Mẫu 10 ngày 20 ngày 30 ngày 40 ngày 50 ngày 60 ngày
Trung bình HG 0,22 ± 0,04 1,14 ± 0,12 1,91 ± 0,13 2,73 ± 0,21 3,40 ± 0,29 4,14 ± 0,41 2,26 CB 0,39 ± 0,13 1,56 ± 0,26 2,90 ± 0,30 4,23 ± 0,37 5,45 ± 0,63 6,99 ± 0,37 3,59 BK 0,94 ± 0,14 2,10 ± 0,24 3,23 ± 0,29 4,41 ± 0,27 5,59 ± 0,43 6,89 ± 0,52 3,86 TQ 1,52 ± 0,34 3,06 ± 0,32 4,70 ± 0,48 6,42 ± 0,66 8,00 ± 0,68 9,69 ± 0,73 5,57 TN 3,04 ± 0,11 5,95 ± 0,11 9,04 ± 0,09 12,15 ± 0,11 15,03 ± 0,27 18,01 ± 0,44 10,54 BG 3,77 ± 0,36 7,41 ± 0,52 10,92 ± 0,67 14,51 ±0,86 18,02 ± 0,85 21,51 ± 0,76 12,69 Trung bình 1,65 3,54 5,45 7,41 9,25 11,20
Kết quả thể hiện ở bảng 3.1 cho ta thấy sau 10 – 20 – 30 – 40 – 50 – 60 ngày, tất cả các giống ngô nghiên cứu đều bị mọt xâm hại, mức độ thức ăn hao hụt tăng theo thời gian: Sau 10 ngày, lƣơng ngơ hao hụt trung bình ở các giống ngơ nghiên cứu là 1,65 g; sau 20 ngày là 3,54 g; sau 30 ngày là 5,45 g;
sau 40 ngày là 7,41 g; sau 50 ngày là 9,25 g, sau 60 ngày 11,20 g. Ở ngày thứ 60 trọng lƣợng hao hụt của giống ngô BG là cao nhất (21,51 g) và thấp nhất là giống ngô HG (4,14 g).
Để kiểm tra xem lƣợng ngô hao hụt ở các mẫu thí nghiệm trên có thực sự khác nhau hay khơng, chúng tôi thực hiện phƣơng pháp so sánh nhiều mẫu độc lập theo tiêu chuẩn phi tham số của Kruskal và Wallis [12], kết quả tính đƣợc giá trị H = 17,16 > X5(0,005) = 16,75. Do đó có thể kết luận: Lƣợng thức ăn hao hụt ở các mẫu thí nghiệm thực sự khác nhau ở mức tin cậy 99,5%.
Hình 3.1. Biểu đồ biểu diễn lƣợng thức ăn hao hụt theo thời gian
ở các mẫu ngô nghiên cứu
Kết quả thể hiện ở hình 3.1 cho ta thấy lƣợng ngơ hao hụt do mọt ăn tăng dần theo thời gian. Lƣợng hao hụt càng cao chứng tỏ khả năng kháng mọt của mẫu ngô kém và ngƣợc lại. Dựa vào số liệu và biểu đồ trên, có thể nhận thấy mẫu ngô HG là giống kháng mọt tốt nhất (lƣợng thức ăn hao hụt trung bình là 2,26 g) và mẫu ngô BG là giống kháng mọt kém nhất (lƣợng
thức ăn hao hụt trung bình là 12,69 g). Chúng tơi lựa chọn hai mẫu này để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
3.2. KẾT QUẢ PHÂN LẬP GEN CYSTATIN 10
3.2.1. Kết quả tách chiết RNA tổng số
Chúng tôi sử dụng lá non 7 ngày tuổi của 2 mẫu ngô BG và HG để tách chiết RNA tổng số. Sau khi tách chiết, chúng tôi kiểm tra chất lƣợng RNA tổng số bằng cách đo trên máy quang phổ NanoDrop, kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Giá trị tỉ lệ phổ hấp thụ A260/A280 và hàm lƣợng RNA của giống
ngô nghiên cứu
TT Giống A260/A280 Hàm lượng RNA (ng/µl)
1 HG 1,92 500
2 BG 1,96 786
3.2.2. Kết quả tổng hợp cDNA và nhân gen
Để tiến hành nhân gen Cystatin 10 của mẫu ngô kháng mọt tốt bằng
phƣơng pháp RT-PCR, chúng tơi đã dựa vào trình tự gen Cystatin 10 đƣợc phân lập từ ngơ có mã số BN000514 đƣợc cơng bố trên Ngân hàng gen NCBI để thiết kế c p mồi đ c hiệu. Thành phần phản ứng đƣợc thể hiện ở bảng 2.1.
Trong q trình thực hiện, chúng tơi nhận thấy rằng phản ứng PCR xảy ra tối ƣu trong điều kiện nhiệt độ gắn mồi là 58oC. Sau chu kỳ phản ứng, kết quả nhân gen đƣợc kiểm tra trên gel agarose 1% với Marker 1kb và đƣợc trình bày ở hình 3.2.
Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm RT - PCR nhân gen Cystatin 10 ở 2
giống ngô nghiên cứu
Kết quả thể hiện ở hình 3.2 cho thấy mẫu cả 2 mẫu (BG và HG) đều cho sản phẩm với kích thƣớc khoảng 450 bp, kích thƣớc này phù hợp theo tính tốn lý thuyết và tƣơng ứng với kích thƣớc của gen Cystatin10 của giống ngô mang mã số BN000514 công bố trong ngân hàng gen quốc tế. Nhƣ vậy, bƣớc đầu có thể sơ bộ kết luận đã nhân đƣợc gen Cystatin10 từ khuôn cDNA.
3.2.3. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR
Thơng thƣờng sau khi chạy PCR, ngồi đoạn gen quan tâm cịn có các sản phẩm phụ không mong muốn, các nucleotide dƣ thừa sau phản ứng, mồi, enzyme... Những chất lẫn tạp này có thể ảnh hƣởng đến các kết quả của q trình tách dịng. Vì vậy, để quá trình biến nạp đạt hiệu quả cao nhất, chúng tôi tiến hành tinh sạch sản phẩm bằng bộ kít: GeneJET Gel Extraction Kit của hãng Thermo.
Các đoạn gen sau khi tinh sạch đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% để kiểm tra chất lƣợng. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR đƣợc trình bày ở hình 3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm làm sạch gen cho ta thấy một băng DNA duy nhất với kích thƣớc khoảng 450bp, chứng tỏ đã thu nhận đƣợc đoạn gen mong muốn. Các băng vạch rõ nét chứng tỏ các DNA không bị đứt gãy trong quá trình tinh sạch, có thể tiến hành tiếp phản ứng ghép nối sản phẩm PCR vào vector tách dịng.
Hình 3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm tinh sạch gen Cystatin 10
ở 2 mẫu ngô nghiên cứu.
3.2.4. Kết quả tách dòng gen
Sau khi tinh sạch đƣợc sản phẩm RT - PCR ở trên, sản phẩm đƣợc gắn trực tiếp vào vector tách dòng pBT. Hỗn hợp đƣợc ủ ở 22oC trong 1giờ 30 phút với sự xúc tác của enzyme T4 ligase cho phản ứng xảy ra hồn tồn. Sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α bằng cách sốc nhiệt ở 42 oC trong 1 phút 30 giây và tiến hành nuôi cấy trên môi trƣờng LB đ c. Sau 16 giờ nuôi ổn định ở 37oC, các khuẩn lạc xanh và khuẩn lạc trắng mọc đƣợc trên môi trƣờng chứng tỏ chúng đều mang vector pBT. Khuẩn lạc xanh là các khuẩn lạc mang pBT tự đóng vịng nên vẫn cịn khả năng sinh tổng hợp protein β-galactosidase để phân giải cơ chất X-gal từ không màu thành màu xanh. Còn các khuẩn lạc màu trắng do mang vector pBT đã gián đoạn gen
lacZ nên không thể phân giải cơ chất thành màu xanh, đây chính là dịng
khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp.
Chọn khuẩn lạc có màu trắng, hình trịn trên đĩa thạch chuyển sang nuôi cấy trên môi trƣờng LB lỏng (bổ sung ampicilin) nuôi qua đêm. Lấy dịch nuôi khuẩn tiến hành phản ứng colony- PCR với c p mồi đ c hiệu đã nhân gen để xác định khuẩn lạc mang gen mong muốn. Kiểm tra sản phẩm colony-
500 bp→ ← 450 bp
PCR bằng điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% trong dung dịch TAE 1X và đƣợc thể hiện trên hình 3.4.
Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm colony – PCR gen Cystatin 10
ở 2 mẫu ngô nghiên cứu.
Kết quả điện di ở hình 3.4 cho thấy, sản phẩm phản ứng colony- PCR từ khuẩn lạc màu trắng thu đƣợc một băng duy nhất có kích thƣớc khoảng 450 bp, kích thƣớc này phù hợp với kích thƣớc của gen Cystatin 10 đã nhân ở trên.
3.2.5. Kết quả tách plasmid tái tổ hợp
Kết quả tách plasmid tái tổ hợp của gen Cystatin 10
Chọn lọc khuẩn lạc trắng tƣơng ứng với các mẫu nghiên cứu có sản phẩm colony PCR ở trên để tách plasmid tái tổ hợp. Sản phẩm DNA plasmid tái tổ hợp đƣợc điện di trên gel agarose 1% trong TAE 1X. Kết quả điện di plasmid mang gen Cystatin 10 thể hiện ở hình 3.5.
← 450 bp 500 bp→
Hình 3.5. Hình ảnh điện di tách plasmid tái tổ hợp
Kết quả điện di trên hình 3.5 cho thấy, sản phẩm tách plasmid tái tổ hợp mang gen Cystatin 10 đạt kết quả tốt, các băng vạch gọn và rõ nét. Theo tính tốn lý thuyết, vector pBT có kích thƣớc 2705 bp, sản phẩm PCR gen đích khoảng 450 bp thì plasmid tái tổ hợp có kích thƣớc khoảng 3155 bp. Nhƣ vậy, chứng tỏ plasmid tái tổ hợp không bị đứt gãy, đảm bảo chất lƣợng và số lƣợng để tiến hành đọc trình tự nucleotide của gen Cystatin 10.
3.3. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN
Để xác định trình tự nucleotide của gen đã tách dịng, chúng tơi gửi đọc trình tự nucleotide của gen quan tâm trên thiết bị giải trình tự tự động ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer tại viện Công nghệ Sinh học. Kết quả đƣợc phân tích bằng phần mềm BioEdit.
Kết quả xác định trình tự gen đƣợc so sánh trên phần mềm BLAST của Ngân hàng gen NCBI cho thấy, trình tự gen mà chúng tơi phân lập có độ tƣơng đồng cao so với trình tự gen có mã số BN000514 trên NCBI. Nhƣ vậy, trình tự gen của hai mẫu ngơ nghiên cứu đã đƣợc xác định chính xác.
← 3155 bp 3000 bp →
3.3.1. Kết quả so sánh trình t gen Cystatin 10 của hai mẫu ngô BG và HG
3.3.1.1. So sánh trình tự gen Cystatin 10 của hai mẫu ngơ BG và HG
Chúng tơi tiến hành so sánh trình tự gen Cystatin 10 của giống ngô BG
và HG với nhau, kết quả đƣợc trình bày ở hình 3.6, bảng 3.3 và bảng 3.4.
Hình 3.6. So sánh trình tự gen Cystatin 10 của hai mẫu ngô BG, HG
Kết quả thể hiện ở hình 3.6 cho thấy trình tự gen của hai mẫu ngơ nghiên cứu đều có kích thƣớc 447 bp, hai trình tự này khác nhau ở 06 vị trí (191, 195, 214, 306, 331, 390).
Bảng 3.3. Sự sai khác giữ các trình tự gen Cystatin 10 của hai mẫu ngô BG, HG Mẫu Vị trí BG HG 191 A C 195 G T 214 G T 306 G A 331 G A 390 G C
Kết quả thể hiện ở bảng 3.3 cho thấy trình tự nucleotide tại vị trí 191 của mẫu ngơ BG là A (Adenine), HG là C (Cytosine); trình tự nucleotide tại hai vị trí 195, 214 của mẫu ngơ BG là G (Guanine), HG là T (Thymine); trình tự nucleotide tại hai vị trí 306, 331 của mẫu ngơ BG là G, HG là A; trình tự nucleotide tại vị trí 390 của mẫu ngô BG là G, HG là C.
Bảng 3.4. Hệ số tƣơng đồng giữa các trình tự gen của hai mẫu ngô BG, HG (%)
Mẫu BG HG
BG 100 98,6
HG 100
Kết quả thể hiện ở bảng 3.4 cho thấy hệ số tƣơng đồng của trình tự gen cystatin 10 ở mẫu ngô BG và HG là 98,6%.
3.3.1.2. So sánh trình tự amino acid của protein suy diễn từ gen Cystatin 10 ở hai mẫu ngô BG và HG
Kết quả so sánh trình tự amino acid của protein suy diễn từ gen
Cystatin 10 ở hai mẫu ngơ BG, HG đƣợc trình bày qua hình 3.7, bảng 3.5 và
bảng 3.6.
Hình 3.7. Trình tự amino acid suy diễn của protein Cystatin 10 ở hai mẫu
nghiên cứu
Kết quả thể hiện ở hình 3.7 cho thấy chuỗi polypeptide của hai mẫu ngơ BG, HG đều có chiều dài 148 amino acid, trình tự amino acid của hai chuỗi này có sự khác nhau ở 04 vị trí (64, 65, 72, 111).
Bảng 3.5. Sự sai khác về trình tự amino acid suy diễn của protein Cystatin10
ở hai giống ngô BG, HG
Mẫu Vị trí BG HG 64 Q P 65 E D 72 A S 111 E K
Kết quả thể hiện ở bảng 3.5 cho thấy trình tự amino acid tại vị trí 64 của mẫu ngơ BG là Q, HG là P; trình tự amino acid tại vị trí 62 của mẫu ngơ BG là E, HG là D; trình tự amino acid tại vị trí 72 của mẫu ngơ BG là A, HG là S; trình tự amino acid tại vị trí 111 của mẫu ngô BG là E, HG là K.
Bảng 3.6. Hệ số tƣơng đồng giữa các trình tự amino acid của 2 mẫu
nghiên cứu (%)
Mẫu BG HG
BG 100 97,2
HG 100
Kết quả thể hiện ở bảng 3.6 cho thấy hệ số tƣơng đồng về trình tự amino acid suy diễn của protein cystatin 10 ở mẫu ngô BG và HG là 97,2%.
Sự sai khác về trình tự nucleotide và amino acid suy diễn ở trên là cơ sở để so sánh khả năng kháng mọt giữa hai giống ngô kháng mọt tốt nhất và kháng mọt kém nhằm tìm kiếm tính quy luật của sự thay đổi vị trí các nucleotide và amino acid liên quan đến tính kháng mọt của các giống ngơ. Đây chính là tiền đề cơ sở cho việc nghiên cứu chọn tạo các giống ngơ có khả năng kháng mọt tốt, năng suất cao, phục vụ sản xuất và đời sống.
3.3.2. Kết quả so sánh hai trình t nghiên cứu (BG, HG) với hai trình t đã được công bố (CB2, MX4) và BN000514 trên GenBank
3.3.2.1. So sánh trình tự gen Cystatin 10 của hai mẫu nghiên cứu (BG, HG) với hai trình tự đã được cơng bố (CB2, MX4) và BN000514 trên ngân hàng gen
Chúng tôi tiến hành so sánh trình tự gen Cystatin 10 của hai mẫu
nghiên cứu (BG, HG) với hai trình tự đã đƣợc cơng bố CB2, MX4 (CB2 là giống ngô địa phƣơng ở tỉnh Cao Bằng, MX4 là giống ngô lai) [10] và BN000514 trên Ngân hàng gen NCBI, kết quả đƣợc trình bày ở hình 3.8, bảng 3.7 và bảng 3.8.
Hình 3.8. So sánh trình tự gen Cystatin 10 của BG, HG với CB2, MX4 và
Kết quả thể hiện ở hình 3.7 cho thấy các trình tự gen đƣợc so sánh có sự khác nhau ở 15 vị trí (30, 50, 108, 110, 168, 176, 204, 207, 226, 252, 255, 261, 327, 352, 411). Đ c biệt, cả bốn mẫu ngô Việt Nam là BG, HG, CB2, MX4 đều bị mất 12 nucleotide (từ vị trí số 61 đến 72) so với trình tự gen
Cystatin10 có mã số BN000514 trên Ngân hàng gen. Hơn nữa, riêng hai mẫu
nghiên cứu bị mất 9 nucleotide (từ vị trí số 262 đến 270) so với trình tự gen
Cystatin10 có mã số BN000514 trên Ngân hàng gen.
Do có sự mất nucleotide nên kích thƣớc gen Cystatin 10 của bốn mẫu (BG, HG, CB2, MX4) ngắn hơn so với kích thƣớc gen cystatin 10 của BN000514 trên Ngân hàng gen, cụ thể là: Kích thƣớc gen cystatin 10 của BN000514 là 468 bp, BG và HG là 447 bp, CB2 và MX4 là 453 bp. Nhƣ vậy là gen cystatin 10 của BG và HG có kích thƣớc ngắn hơn gen cystatin 10 của CB2, MX4 và BN000514.
Kết quả thể hiện ở hình 3.7 cịn cho ta thấy có sự sai khác giống nhau về trình tự nucleotide của bốn mẫu BG, HG, CB2, MX4 tại hai vị trí so với trình tự nucleotide của BN000514, cụ thể là: Tại vị trí 108, trình tự nucleotide của BN000514 là T, trình tự nucleotide của BG, HG, CB2, MX4 là C; Tại vị trí 176, trình tự nucleotide của BN000514 là C, trình tự nucleotide của BG, HG, CB2, MX4 là G.
Đ c biệt, ở hai giống ngơ có khả năng kháng mọt tốt (HG và CB) có sự sai khác giống nhau về trình tự nucleotide tại ba vị trí so với trình tự nucleotide của BN000514, cụ thể là: Tại hai vị trí 327, 352 trình tự nucleotide của BN000514 là G, trình tự nucleotide của HG, CB2 là A; Tại vị trí 411, trình tự nucleotide của BN000514 là G, trình tự nucleotide của HG, CB2 là C.
Bảng 3.7. Sự khác nhau giữa trình tự gen Cystatin 10 của BG, HG với CB2, MX4 và BN000514 trên GenBank Mẫu Vị trí BN000514 HG CB2 BG MX4 30 G G C G G 50 C C C C G 108 T C C C C 110 G G A G G 168 G G C G G 176 C G G G G 204 A C A A A 207 G T G G G 226 G T G G G 252 A A C A A 255 T T C T T 261 C C G C C 327 G A A G G 352 G A A G G 411 G C C G C
Kết quả thể hiện ở bảng 3.7 cho thấy trình tự nucleotide của BG có sự sai khác với trình tự nucleotide của BN000514 tại 2 vị trí (108, 176), sai khác với trình tự nucleotide của CB2 tại 9 vị trí (30, 110, 168, 252, 255, 261, 327, 352, 411), sai khác với trình tự nucleotide của MX4 tại 2 vị trí (50, 411). Trình tự nucleotide của HG có sự sai khác với trình tự nucleotide của BN000514 tại 8 vị trí (108, 176, 204, 207, 226, 327, 352, 411), sai khác với trình tự nucleotide của CB2 tại 9 vị trí (30, 110, 168, 204, 207, 226, 252, 255, 261), sai khác với trình tự nucleotide của MX4 tại 6 vị trí (50, 204, 207, 226, 327, 352).
Nhƣ vậy, sự sai khác về trình tự nucleotide của BG so với BN000514 (2 vị trí) là ít hơn sự sai khác về trình tự nucleotide của HG so với BN000514 (8 vị trí). Sự sai khác về trình tự nucleotide của BG so với CB2 (9 vị trí) bằng với sự sai khác về trình tự nucleotide của HG so với CB2 (9 vị trí), tuy nhiên các vị trí sai khác khơng hồn tồn trùng nhau. Sự sai khác về trình tự