3. Nội dung nghiên cứu
3.3. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN
Để xác định trình tự nucleotide của gen đã tách dòng, chúng tôi gửi đọc trình tự nucleotide của gen quan tâm trên thiết bị giải trình tự tự động ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer tại viện Công nghệ Sinh học. Kết quả đƣợc phân tích bằng phần mềm BioEdit.
Kết quả xác định trình tự gen đƣợc so sánh trên phần mềm BLAST của Ngân hàng gen NCBI cho thấy, trình tự gen mà chúng tôi phân lập có độ tƣơng đồng cao so với trình tự gen có mã số BN000514 trên NCBI. Nhƣ vậy, trình tự gen của hai mẫu ngô nghiên cứu đã đƣợc xác định chính xác.
← 3155 bp 3000 bp →
3.3.1. Kết quả so sánh trình t gen Cystatin 10 của hai mẫu ngô BG và HG
3.3.1.1. So sánh trình tự gen Cystatin 10 của hai mẫu ngô BG và HG
Chúng tôi tiến hành so sánh trình tự gen Cystatin 10 của giống ngô BG
và HG với nhau, kết quả đƣợc trình bày ở hình 3.6, bảng 3.3 và bảng 3.4.
Hình 3.6. So sánh trình tự gen Cystatin 10 của hai mẫu ngô BG, HG
Kết quả thể hiện ở hình 3.6 cho thấy trình tự gen của hai mẫu ngô nghiên cứu đều có kích thƣớc 447 bp, hai trình tự này khác nhau ở 06 vị trí (191, 195, 214, 306, 331, 390).
Bảng 3.3. Sự sai khác giữ các trình tự gen Cystatin 10 của hai mẫu ngô BG, HG Mẫu Vị trí BG HG 191 A C 195 G T 214 G T 306 G A 331 G A 390 G C
Kết quả thể hiện ở bảng 3.3 cho thấy trình tự nucleotide tại vị trí 191 của mẫu ngô BG là A (Adenine), HG là C (Cytosine); trình tự nucleotide tại hai vị trí 195, 214 của mẫu ngô BG là G (Guanine), HG là T (Thymine); trình tự nucleotide tại hai vị trí 306, 331 của mẫu ngô BG là G, HG là A; trình tự nucleotide tại vị trí 390 của mẫu ngô BG là G, HG là C.
Bảng 3.4. Hệ số tƣơng đồng giữa các trình tự gen của hai mẫu ngô BG, HG (%)
Mẫu BG HG
BG 100 98,6
HG 100
Kết quả thể hiện ở bảng 3.4 cho thấy hệ số tƣơng đồng của trình tự gen cystatin 10 ở mẫu ngô BG và HG là 98,6%.
3.3.1.2. So sánh trình tự amino acid của protein suy diễn từ gen Cystatin 10 ở hai mẫu ngô BG và HG
Kết quả so sánh trình tự amino acid của protein suy diễn từ gen
Cystatin 10 ở hai mẫu ngô BG, HG đƣợc trình bày qua hình 3.7, bảng 3.5 và
bảng 3.6.
Hình 3.7. Trình tự amino acid suy diễn của protein Cystatin 10 ở hai mẫu
nghiên cứu
Kết quả thể hiện ở hình 3.7 cho thấy chuỗi polypeptide của hai mẫu ngô BG, HG đều có chiều dài 148 amino acid, trình tự amino acid của hai chuỗi này có sự khác nhau ở 04 vị trí (64, 65, 72, 111).
Bảng 3.5. Sự sai khác về trình tự amino acid suy diễn của protein Cystatin10
ở hai giống ngô BG, HG
Mẫu Vị trí BG HG 64 Q P 65 E D 72 A S 111 E K
Kết quả thể hiện ở bảng 3.5 cho thấy trình tự amino acid tại vị trí 64 của mẫu ngô BG là Q, HG là P; trình tự amino acid tại vị trí 62 của mẫu ngô BG là E, HG là D; trình tự amino acid tại vị trí 72 của mẫu ngô BG là A, HG là S; trình tự amino acid tại vị trí 111 của mẫu ngô BG là E, HG là K.
Bảng 3.6. Hệ số tƣơng đồng giữa các trình tự amino acid của 2 mẫu
nghiên cứu (%)
Mẫu BG HG
BG 100 97,2
HG 100
Kết quả thể hiện ở bảng 3.6 cho thấy hệ số tƣơng đồng về trình tự amino acid suy diễn của protein cystatin 10 ở mẫu ngô BG và HG là 97,2%.
Sự sai khác về trình tự nucleotide và amino acid suy diễn ở trên là cơ sở để so sánh khả năng kháng mọt giữa hai giống ngô kháng mọt tốt nhất và kháng mọt kém nhằm tìm kiếm tính quy luật của sự thay đổi vị trí các nucleotide và amino acid liên quan đến tính kháng mọt của các giống ngô. Đây chính là tiền đề cơ sở cho việc nghiên cứu chọn tạo các giống ngô có khả năng kháng mọt tốt, năng suất cao, phục vụ sản xuất và đời sống.
3.3.2. Kết quả so sánh hai trình t nghiên cứu (BG, HG) với hai trình t đã được công bố (CB2, MX4) và BN000514 trên GenBank
3.3.2.1. So sánh trình tự gen Cystatin 10 của hai mẫu nghiên cứu (BG, HG) với hai trình tự đã được công bố (CB2, MX4) và BN000514 trên ngân hàng gen
Chúng tôi tiến hành so sánh trình tự gen Cystatin 10 của hai mẫu
nghiên cứu (BG, HG) với hai trình tự đã đƣợc công bố CB2, MX4 (CB2 là giống ngô địa phƣơng ở tỉnh Cao Bằng, MX4 là giống ngô lai) [10] và BN000514 trên Ngân hàng gen NCBI, kết quả đƣợc trình bày ở hình 3.8, bảng 3.7 và bảng 3.8.
Hình 3.8. So sánh trình tự gen Cystatin 10 của BG, HG với CB2, MX4 và
Kết quả thể hiện ở hình 3.7 cho thấy các trình tự gen đƣợc so sánh có sự khác nhau ở 15 vị trí (30, 50, 108, 110, 168, 176, 204, 207, 226, 252, 255, 261, 327, 352, 411). Đ c biệt, cả bốn mẫu ngô Việt Nam là BG, HG, CB2, MX4 đều bị mất 12 nucleotide (từ vị trí số 61 đến 72) so với trình tự gen
Cystatin10 có mã số BN000514 trên Ngân hàng gen. Hơn nữa, riêng hai mẫu
nghiên cứu bị mất 9 nucleotide (từ vị trí số 262 đến 270) so với trình tự gen
Cystatin10 có mã số BN000514 trên Ngân hàng gen.
Do có sự mất nucleotide nên kích thƣớc gen Cystatin 10 của bốn mẫu (BG, HG, CB2, MX4) ngắn hơn so với kích thƣớc gen cystatin 10 của BN000514 trên Ngân hàng gen, cụ thể là: Kích thƣớc gen cystatin 10 của BN000514 là 468 bp, BG và HG là 447 bp, CB2 và MX4 là 453 bp. Nhƣ vậy là gen cystatin 10 của BG và HG có kích thƣớc ngắn hơn gen cystatin 10 của CB2, MX4 và BN000514.
Kết quả thể hiện ở hình 3.7 còn cho ta thấy có sự sai khác giống nhau về trình tự nucleotide của bốn mẫu BG, HG, CB2, MX4 tại hai vị trí so với trình tự nucleotide của BN000514, cụ thể là: Tại vị trí 108, trình tự nucleotide của BN000514 là T, trình tự nucleotide của BG, HG, CB2, MX4 là C; Tại vị trí 176, trình tự nucleotide của BN000514 là C, trình tự nucleotide của BG, HG, CB2, MX4 là G.
Đ c biệt, ở hai giống ngô có khả năng kháng mọt tốt (HG và CB) có sự sai khác giống nhau về trình tự nucleotide tại ba vị trí so với trình tự nucleotide của BN000514, cụ thể là: Tại hai vị trí 327, 352 trình tự nucleotide của BN000514 là G, trình tự nucleotide của HG, CB2 là A; Tại vị trí 411, trình tự nucleotide của BN000514 là G, trình tự nucleotide của HG, CB2 là C.
Bảng 3.7. Sự khác nhau giữa trình tự gen Cystatin 10 của BG, HG với CB2, MX4 và BN000514 trên GenBank Mẫu Vị trí BN000514 HG CB2 BG MX4 30 G G C G G 50 C C C C G 108 T C C C C 110 G G A G G 168 G G C G G 176 C G G G G 204 A C A A A 207 G T G G G 226 G T G G G 252 A A C A A 255 T T C T T 261 C C G C C 327 G A A G G 352 G A A G G 411 G C C G C
Kết quả thể hiện ở bảng 3.7 cho thấy trình tự nucleotide của BG có sự sai khác với trình tự nucleotide của BN000514 tại 2 vị trí (108, 176), sai khác với trình tự nucleotide của CB2 tại 9 vị trí (30, 110, 168, 252, 255, 261, 327, 352, 411), sai khác với trình tự nucleotide của MX4 tại 2 vị trí (50, 411). Trình tự nucleotide của HG có sự sai khác với trình tự nucleotide của BN000514 tại 8 vị trí (108, 176, 204, 207, 226, 327, 352, 411), sai khác với trình tự nucleotide của CB2 tại 9 vị trí (30, 110, 168, 204, 207, 226, 252, 255, 261), sai khác với trình tự nucleotide của MX4 tại 6 vị trí (50, 204, 207, 226, 327, 352).
Nhƣ vậy, sự sai khác về trình tự nucleotide của BG so với BN000514 (2 vị trí) là ít hơn sự sai khác về trình tự nucleotide của HG so với BN000514 (8 vị trí). Sự sai khác về trình tự nucleotide của BG so với CB2 (9 vị trí) bằng với sự sai khác về trình tự nucleotide của HG so với CB2 (9 vị trí), tuy nhiên các vị trí sai khác không hoàn toàn trùng nhau. Sự sai khác về trình tự nucleotide của BG so với MX4 (2 vị trí) là ít hơn sự sai khác về trình tự nucleotide của HG so với MX4 (6 vị trí). Do đó, hệ số tƣơng đồng giữa các trình tự trên có sự khác biệt (Bảng 3.8).
Kết quả thể hiện ở bảng 3.7 còn cho thấy điều đ c biệt là tại hai vị trí (327, 352) ở hai giống ngô kháng mọt tốt (HG, CB2) đều là A, còn ở hai giống ngô kháng mọt kém (BG, MX4) đều là G. Điều này chứng tỏ là khả năng kháng mọt tốt và kém có thể liên quan đến trình tự nucleotide tại hai vị trí này.
Bảng 3.8. Hệ số tƣơng đồng giữa các trình tự gen của 2 mẫu nghiên cứu với
CB2, MX4 và BN000514 trên GenBank BN000514 BG HG CB2 MX4 BN000514 100 95,0 93,8 94,4 95,9 BG 100 98,6 96,6 96,9 HG 100 96,6 96,0 CB2 100 96,7 MX4 100
Kết quả thể hiện ở bảng 3.8 cho thấy hệ số tƣơng đồng của mẫu BG với BN000514, CB2, MX4 lần lƣợt là 95,0%, 96,6%, 96,9%; hệ số tƣơng đồng của mẫu HG với BN000514, CB2, MX4 lần lƣợt là 93,8%, 96,6%, 96,0%.
3.3.2.2. So sánh trình tự amino acid của protein suy diễn từ gen cystatin 10 ở hai mẫu ngô BG, HG với CB2, MX4 và BN000514
Kết quả so sánh trình tự amino acid của protein suy diễn từ gen Cystatin 10 ở hai mẫu ngô BG, HG với CB2, MX4 và BN000514 đƣợc trình bày qua hình 3.9, bảng 3.9 và bảng 3.10.
Hình 3.9. Trình tự amino acid suy diễn của protein Cystatin 10 ở hai mẫu
nghiên cứu với CB2, MX4 và BN000514 trên GenBank
Kết quả thể hiện ở hình 3.9 cho thấy trình tự các chuỗi polypeptide có sự sai khác ở 8 vị trí (17, 37, 59, 68, 69, 76, 84, 118) và có sự đột biến mất amino acid ở một số vị trí, cụ thể là: Tại vị trí 24, 25, 26, 27 cả bốn mẫu BG, HG, CB2, MX4 đều bị đột biến mất bốn amino acid (P, A, A, A) so với BN000514; Tại vị trí 88, 89, 90 có mẫu BG và HG bị đột biến mất ba amino acid (G, G, G) so với BN000514; Tại vị trí 90 có mẫu CB2 bị đột biến mất một amino acid (G) so với BN000514; Tại vị trí 122 có mẫu MX4 bị đột biến mất một amino acid (G) so với BN000514.
Bảng 3.9. Sự sai khác về trình tự amino acid suy diễn của protein Cystatin10
ở hai mẫu nghiên cứu với CB2, MX4 và BN000514 trên GenBank
Mẫu Vị trí BN000514 HG CB2 BG MX4 17 A A A A G 37 G G E G G 59 P R R R R 68 Q P Q Q Q 69 E D E E E 76 A S D A E 84 E E D E E 118 E K K E E
Kết quả thể hiện ở bảng 3.9 cho thấy trình tự amino acid của protein Cystatin 10 ở hai mẫu nghiên cứu (BG, HG) có sự sai khác so với mẫu CB2, MX4 và BN000514, cụ thể là: Trình tự amino acid của BG sai khác với trình tự amino acid của BN000514 tại vị trí 59, sai khác với trình tự amino acid của CB2 tại 4 vị trí (37, 76, 84, 118), sai khác với trình tự amino acid của MX4 tại 2 vị trí (17, 76). Trình tự amino acid của HG sai khác với trình tự amino acid của BN000514 tại 5 vị trí (59, 68, 69, 76, 118), sai khác với trình tự amino acid của CB2 tại 5 vị trí (37, 68, 69, 76, 84), sai khác với trình tự amino acid của MX4 tại 5 vị trí (17, 68, 69, 76, 118).
Nhƣ vậy, sự sai khác về trình tự amino acid của BG với trình tự amino acid của BN000514, CB2, MX4 (7 vị trí sai khác) là ít hơn so với sự sai khác về trình tự amino acid của HG với trình tự amino acid của BN000514, CB2, MX4 (15 vị trí sai khác).
Kết quả thể hiện ở bảng 3.9 còn cho thấy điều đ c biệt là tại vị trí 118, hai giống ngô kháng mọt tốt (HG, CB2) đều có trình tự amino acid là K, còn hai giống ngô kháng mọt kém (BG, MX4) có trình tự amino acid là E. Do đó, khả năng kháng mọt tốt và kém có thể liên quan đến trình tự amino acid tại vị trí này.
Bảng 3.10. Hệ số tƣơng đồng giữa các trình tự amino acid của 2 mẫu
nghiên cứu với CB2, MX4 và BN000514 trên GenBank
Mẫu BN000514 BG HG CB2 MX4 BN000514 100 94,8 92,2 94,1 95,4 BG 100 97,2 96,6 96,6 HG 100 95,3 94,0 CB2 100 96,0 MX4 100
Kết quả thể hiện ở bảng 3.10 cho thấy hệ số tƣơng đồng của mẫu BG với BN000514, CB2, MX4 lần lƣợt là 94,8%, 96,6%, 96,6%; hệ số tƣơng đồng của mẫu HG với BN000514, CB2, MX4 lần lƣợt là 92,2%, 95,3%, 94,0%.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ I. Kết luận
1. Đã xác định đƣợc mức độ kháng mọt của 6 giống ngô nghiên cứu. Trong đó, giống có khả năng kháng mọt tốt nhất là HG và giống có khả năng kháng mọt kém nhất là BG.
2. Đã phân lập và xác định đƣợc trình tự gen Cystatin 10 của mẫu ngô HG và BG với kích thƣớc 447 bp.
3. Hệ số tƣơng đồng trình tự nucleotide của gen Cystatin10 ở 2 mẫu nghiên cứu là 98,6%. Hệ số tƣơng đồng của trình tự nucletide ở mẫu BG với BN000514, CB2, MX4 lần lƣợt là 95,0%, 96,6%, 96,9%; hệ số tƣơng đồng của mẫu HG với BN000514, CB2, MX4 lần lƣợt là 93,8%, 96,6%, 96,0%.
4. Trình tự amino acid suy diễn từ protein Cystatin10 của 2 mẫu nghiên cứu có độ tƣơng đồng là 97,2%. Hệ số tƣơng đồng của trình tự amino acid suy diễn từ protein Cystatin10 của mẫu BG với BN000514, CB2, MX4 lần lƣợt là 94,8%, 96,6%, 96,6%; hệ số tƣơng đồng của mẫu HG với BN000514, CB2, MX4 lần lƣợt là 92,2%, 95,3%, 94,0%.
II. Đề nghị
Tiếp tục thiết kế vector phục vụ chuyển gen để có thể tạo ra đƣợc những giống ngô có khả năng kháng mọt tốt.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Trần Văn Chƣơng (2000), Khảo sát hiện trạng chất lượng ngô 4 huyện
vùng núi cao phía Bắc tỉnh Hà Giang và một số biện pháp thích hợp giảm tổn thất sau thu hoạch, Báo cáo kết quả nghiên cứu khoa học, Sở Khoa học và
Công nghệ Hà Giang.
2. Đƣờng Hồng Dật (2004), Cây ngô: kỹ thuật thâm canh tăng năng suất, NXB Lao động - Xã hội.
3. Đƣờng Hồng Dật (2006), Sâu bệnh hại ngô, cây lương thực trồng cạn và
biện pháp phòng trừ, NXB Lao động - Xã hội.
4. Lê Doãn Diên (1995), Sử dụng kỹ thuật của công nghệ sinh học để bảo quản, chế biến nông sản sau thu hoạch, NXB Nông nghiệp.
5. Trƣơng Văn Đích, (2005), Kĩ thuật trồng ngô năng suất cao, NXB Khoa học và Kỹ thuật.
6. Nguyễn Xuân Hiển (1972), Một số kết quả nghiên cứu về cây ngô, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
7. Mai Lề, Bùi Đức Hợi, Lƣơng Hồng Nga, Phạm Văn Hùng, (2009), Công nghệ bảo quản lương thực, NXB khoa học và kỹ thuật Hà Nội, tr: 28 – 36.
8. Bùi Công Hiển (1995), Côn trùng hại kho, NXB Khoa học và kỹ thuật Hà
Nội.
9. Hà Quang Hùng (2005), Giáo trình Kiểm dịch thực vật và dịch hại nông sản sau thu hoạch, NXB Nông nghiệp.
10. Dƣơng Thị Hồng Khánh (2015), “Xác định trình tự gen Cystatin10 của 2
11. Nguyễn Đức Lƣơng, Dƣơng Văn Sơn, Lƣơng Văn Hinh (2000), Giáo trình cây lương ngô, NXB Nông nghiệp.
12. Chu Văn Mẫn (2003), Ứng dụng tin học trong sinh học, NXB ĐHQG Hà Nội.
13. Trần Văn Minh, (2008), Cây ngô nghiên cứu và sản xuất, NXB nông
nghiệp, Hà Nội.
14. Ngô Hữu Tình (1997), Cây ngô, NXB nông nghiệp. 15. Ngô Hữu Tình (2003), Cây ngô, NXB Nghệ An.
16. Quyền Đình Thi, Nông Văn Hải (2008), Những kỹ thuật PCR và ứng dụng trong phân tích DNA, tập II, NXB Khoa học Tự nhiên và Công nghệ.
17. Vì Thị Xuân Thủy, Hồ Mạnh Tƣờng, Lê Văn Sơn, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Chu Hoàng Mậu (2014), “Tách dòng gen Cystatin2 phân lập từ một số mẫu ngô địa phƣơng Việt Nam”, Tạp chí sinh học, 36(1): 110-117.
18. Vũ Thị Thu Thủy (2011), “Tạo dòng chịu hạn và phân lập gen Cystatin
liên quan đến tính chịu hạn ở cây lạc”, Luận án tiến sĩ sinh học, Trƣờng Đại
học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên.
19. Phòng Kiểm dịch thực vật - Cục Bảo vệ thực vật (2003), Thành phần côn trùng hại kho ở Việt Nam năm 1996 - 2000, một số ứng dụng bảo vệ thực vật vào sản xuất nông nghiệp, NXB Nông nghiệp.
20. Vũ Quốc Trung (1981), “Sâu hại nông sản trong kho và phòng trừ”,