Bước Phản ứng Nhiệt ộ (0
C) Thời gian Chu kỳ
1 Biến tính 94 4 phút 1
2 Biến tính 94 30 giây
30
3 Gắn mồi 58 30 giây
4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút
5 Hoàn tất kéo dài 72 7 phút 1
6 Kết thúc phản ứng 4 ∞
Sản phẩm PCR chọn dòng đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X. Sau đó nhuộm gel trong ethidium bromide và chụp ảnh dƣới ánh sáng đèn cực tím.
2.3.2.7. Tách plasmid tái tổ hợp
- Giữ chủng vi khuẩn : Cho 300 µl glycerol 100% và 700 µl khuẩn
cho vào nito lỏng. Sau đó đƣa vào tủ -80oC để bảo quản. Nếu giữ ở tủ -20o
C, lấy 500 µl khuẩn và 500 µl glycerol 50%.
- Tách plasmid:
A. Chuẩn bị
1. Sol I: 50 mM glucose; 25 mM Tris-HCl pH=8,0; 10 mM EDTA pH=8,0
2. Sol II: 0,2N NaOH; 1% SDS (phá vỡ màng tế bào)
3. Sol III: 60 ml CH3COOK 5M; 11,5 ml acetic acid; 28,5 ml H2O 4. Dung dịch: Phenol: Chloroform(1:1)
5. Lysozyme : 20 mg/ml
Các dung dịch pha ở trên đƣợc bảo quản trong tủ lạnh (trừ dung dịch SolII) B. Quy trình
1. Hút 2 ml dịch khuẩn cho vào Eppendorf, ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút, 40C.
2. Bỏ dịch nổi, thu sinh khối c n
3. Bổ sung 200 µl Sol I, vortex cho tan đều.
4. Bổ sung 10 µl lysozyme 20 mg/ml, đảo nhẹ, để lắng trong đá 10 phút. 5. Bổ sung 400 µl Sol II lắc nhẹ nhàng 5 lần cho tan đều đ t ngay trong đá. 6. Bổ sung 300 µl Sol III đảo nhẹ vài lần để trong đá lạnh (3-5 phút). 7. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C. Hút dịch nổi (pha trên) cho vào ống Eppendorf mới.
8. Thêm chloroform: Isoamyl (24:1) theo tỉ lệ 1:1 (v/v) vortex đều, ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4o
C. Hút dịch pha trên cho vào ống Eppendorf mới.
9. Bổ sung Isopropanol theo tỉ lệ 1:1 để trong tủ -20o
C trong 30 phút. 10. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút, 40C, loại dịch thu c n.
12. Thêm 1 ml cồn 70% để rửa. Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, 40
C. 13. Bỏ dịch, thu c n, làm khô.
14. Hịa tan c n trong 30 µl nƣớc chứa RNase. 15. Giữ trong tủ -20oC để bảo quản.
2.3.3. Phương pháp xác định trình t nucleotide
Trình tự của gen Cystatin10 đƣợc xác định trên máy đọc trình tự nucleotide tự động tại Viện Cơng nghệ Sinh học - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.3.4. Phương pháp xử lí trình t gen
Sử dụng phần mềm BioEdit, BLAST để phân tích, so sánh.
2.3.5. Phương pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu
Sử dụng phƣơng pháp thống kê bằng phần mềm Microsoft Office Excel [12].
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG MỌT CỦA CÁC GIỐNG NGÔ BẰNG NHIỄM MỌT NHÂN TẠO CÁC GIỐNG NGÔ BẰNG NHIỄM MỌT NHÂN TẠO
Mọt thƣờng tấn cơng vào phơi trƣớc, sau đó đến nội nhũ và các bộ phận khác làm cho hạt chỉ còn lại một lớp vỏ mỏng. Thời gian phá hoại của mọt trong chu kỳ sinh trƣởng tƣơng đối dài. Năng suất, chất lƣợng ngô bị ảnh hƣởng nhiều khi bị mọt tấn công. Để đánh giá khả năng kháng mọt của các mẫu ngơ nghiên cứu, chúng tơi dựa vào việc tính tốn lƣợng thức ăn hao hụt sau một thời gian theo dõi (10 – 20 – 30 – 40 – 50 – 60 ngày) đối với lồi mọt ngơ Sitophilus zeamais. Mỗi lọ thí nghiệm chứa 50 g ngơ hạt sau đó tiến hành gây mọt nhân tạo mỗi lọ thí nghiệm cho vào 15 c p mọt trƣởng thành. Kết quả số liệu đánh giá kháng mọt đƣợc trình bày ở bảng 3.1.