CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.2. KẾT QUẢ PHÂN LẬP GEN CYSTATIN 10
3.2.1. Kết quả tách chiết RNA tổng số
Chúng tôi sử dụng lá non 7 ngày tuổi của 2 mẫu ngô BG và HG để tách chiết RNA tổng số. Sau khi tách chiết, chúng tôi kiểm tra chất lƣợng RNA tổng số bằng cách đo trên máy quang phổ NanoDrop, kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Giá trị tỉ lệ phổ hấp thụ A260/A280 và hàm lƣợng RNA của giống
ngô nghiên cứu
TT Giống A260/A280 Hàm lượng RNA (ng/µl)
1 HG 1,92 500
2 BG 1,96 786
3.2.2. Kết quả tổng hợp cDNA và nhân gen
Để tiến hành nhân gen Cystatin 10 của mẫu ngô kháng mọt tốt bằng
phƣơng pháp RT-PCR, chúng tơi đã dựa vào trình tự gen Cystatin 10 đƣợc phân lập từ ngơ có mã số BN000514 đƣợc công bố trên Ngân hàng gen NCBI để thiết kế c p mồi đ c hiệu. Thành phần phản ứng đƣợc thể hiện ở bảng 2.1.
Trong q trình thực hiện, chúng tơi nhận thấy rằng phản ứng PCR xảy ra tối ƣu trong điều kiện nhiệt độ gắn mồi là 58oC. Sau chu kỳ phản ứng, kết quả nhân gen đƣợc kiểm tra trên gel agarose 1% với Marker 1kb và đƣợc trình bày ở hình 3.2.
Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm RT - PCR nhân gen Cystatin 10 ở 2
giống ngô nghiên cứu
Kết quả thể hiện ở hình 3.2 cho thấy mẫu cả 2 mẫu (BG và HG) đều cho sản phẩm với kích thƣớc khoảng 450 bp, kích thƣớc này phù hợp theo tính tốn lý thuyết và tƣơng ứng với kích thƣớc của gen Cystatin10 của giống ngô mang mã số BN000514 công bố trong ngân hàng gen quốc tế. Nhƣ vậy, bƣớc đầu có thể sơ bộ kết luận đã nhân đƣợc gen Cystatin10 từ khuôn cDNA.
3.2.3. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR
Thơng thƣờng sau khi chạy PCR, ngồi đoạn gen quan tâm cịn có các sản phẩm phụ không mong muốn, các nucleotide dƣ thừa sau phản ứng, mồi, enzyme... Những chất lẫn tạp này có thể ảnh hƣởng đến các kết quả của q trình tách dịng. Vì vậy, để quá trình biến nạp đạt hiệu quả cao nhất, chúng tôi tiến hành tinh sạch sản phẩm bằng bộ kít: GeneJET Gel Extraction Kit của hãng Thermo.
Các đoạn gen sau khi tinh sạch đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% để kiểm tra chất lƣợng. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR đƣợc trình bày ở hình 3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm làm sạch gen cho ta thấy một băng DNA duy nhất với kích thƣớc khoảng 450bp, chứng tỏ đã thu nhận đƣợc đoạn gen mong muốn. Các băng vạch rõ nét chứng tỏ các DNA không bị đứt gãy trong quá trình tinh sạch, có thể tiến hành tiếp phản ứng ghép nối sản phẩm PCR vào vector tách dịng.
Hình 3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm tinh sạch gen Cystatin 10
ở 2 mẫu ngô nghiên cứu.
3.2.4. Kết quả tách dòng gen
Sau khi tinh sạch đƣợc sản phẩm RT - PCR ở trên, sản phẩm đƣợc gắn trực tiếp vào vector tách dòng pBT. Hỗn hợp đƣợc ủ ở 22oC trong 1giờ 30 phút với sự xúc tác của enzyme T4 ligase cho phản ứng xảy ra hồn tồn. Sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α bằng cách sốc nhiệt ở 42 oC trong 1 phút 30 giây và tiến hành nuôi cấy trên môi trƣờng LB đ c. Sau 16 giờ nuôi ổn định ở 37oC, các khuẩn lạc xanh và khuẩn lạc trắng mọc đƣợc trên môi trƣờng chứng tỏ chúng đều mang vector pBT. Khuẩn lạc xanh là các khuẩn lạc mang pBT tự đóng vịng nên vẫn cịn khả năng sinh tổng hợp protein β-galactosidase để phân giải cơ chất X-gal từ không màu thành màu xanh. Còn các khuẩn lạc màu trắng do mang vector pBT đã gián đoạn gen
lacZ nên không thể phân giải cơ chất thành màu xanh, đây chính là dịng
khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp.
Chọn khuẩn lạc có màu trắng, hình trịn trên đĩa thạch chuyển sang nuôi cấy trên môi trƣờng LB lỏng (bổ sung ampicilin) nuôi qua đêm. Lấy dịch nuôi khuẩn tiến hành phản ứng colony- PCR với c p mồi đ c hiệu đã nhân gen để xác định khuẩn lạc mang gen mong muốn. Kiểm tra sản phẩm colony-
500 bp→ ← 450 bp
PCR bằng điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% trong dung dịch TAE 1X và đƣợc thể hiện trên hình 3.4.
Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm colony – PCR gen Cystatin 10
ở 2 mẫu ngô nghiên cứu.
Kết quả điện di ở hình 3.4 cho thấy, sản phẩm phản ứng colony- PCR từ khuẩn lạc màu trắng thu đƣợc một băng duy nhất có kích thƣớc khoảng 450 bp, kích thƣớc này phù hợp với kích thƣớc của gen Cystatin 10 đã nhân ở trên.
3.2.5. Kết quả tách plasmid tái tổ hợp
Kết quả tách plasmid tái tổ hợp của gen Cystatin 10
Chọn lọc khuẩn lạc trắng tƣơng ứng với các mẫu nghiên cứu có sản phẩm colony PCR ở trên để tách plasmid tái tổ hợp. Sản phẩm DNA plasmid tái tổ hợp đƣợc điện di trên gel agarose 1% trong TAE 1X. Kết quả điện di plasmid mang gen Cystatin 10 thể hiện ở hình 3.5.
← 450 bp 500 bp→
Hình 3.5. Hình ảnh điện di tách plasmid tái tổ hợp
Kết quả điện di trên hình 3.5 cho thấy, sản phẩm tách plasmid tái tổ hợp mang gen Cystatin 10 đạt kết quả tốt, các băng vạch gọn và rõ nét. Theo tính tốn lý thuyết, vector pBT có kích thƣớc 2705 bp, sản phẩm PCR gen đích khoảng 450 bp thì plasmid tái tổ hợp có kích thƣớc khoảng 3155 bp. Nhƣ vậy, chứng tỏ plasmid tái tổ hợp không bị đứt gãy, đảm bảo chất lƣợng và số lƣợng để tiến hành đọc trình tự nucleotide của gen Cystatin 10.