Các bƣớc chuẩn bị cho phân tích đo mật độ quang bao gồm:
- Chuẩn bị mẫu: mẫu sau khi làm sạch đƣợc pha loãng ở các tỉ lệ 1, 1/5 và 1/25 trong dung môi DMSO.
- Tạo môi trƣờng ni cấy: các mẫu sau khi pha lỗng ở các tỉ lệ khác nhau đƣợc pha loãng tiếp 100 lần trong môi trƣờng nuôi cấy là media RPMI1640.
- Phơi nhiễm tế bào: cho mẫu vào các giếng chứa tế bào. Tiến hành ủ ở 37oC trong 19-24 giờ.
- Đo huỳnh quang xác định nồng độ TEQ tổng của chất trong mẫu.
Tính tốn kết quả
Sau khi đo huỳnh quanh, kết quả đƣợc tính tốn và xử lý bởi phần mềm chuyên dụng.
Quy trình xử lý số liệu phân tích nhƣ sau: Từ số liệu đo mật độ ánh sáng tƣơng đối (RLU- Relative Light Unit)→Hiệu chỉnh số liệu theo giá trị RLUmax→Tính tốn kết quả theo đƣờng chuẩn sự phụ thuộc của RLU vào nồng độ chất 2,3,7,8-TCDD.
CHƢƠNG 3 –KẾT QUẢ, THẢO LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT GIẢI PHÁP XỬ LÝ DIOXIN
3.1. PHÂN TÍCH XÁC NHẬN PHƢƠNG PHÁP 3.1.1. Đƣờng chuẩn của phƣơng pháp 3.1.1. Đƣờng chuẩn của phƣơng pháp
Đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng nhằm kiểm tra độ chính xác của phép phân tích, đồng thời là cơ sở để xác định hàm lƣợng chất phân tích có trong mẫu.
Đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng dựa trên mối tƣơng quan giữa giá trị nồng độ chất 2,3,7,8-TCDD trong mẫu chuẩn và khả năng đáp ứng quang học của tế bào đối với mẫu chuẩn đó (ln[TCDD*100] và Relative Light Unit-RLU].
Đƣờng chuẩn gồm 10 điểm chuẩn có nồng độ nằm trong khoảng: 0,0488 - 25 ng/mL.Dung dịch chuẩn đƣợc sử dụng là dung dịch D48-DM có thành phần là chất 2,3,7,8-TCDD nồng độ 50 ng/ml DMSO. Để kiểm tra độ chính xác của đƣờng chuẩn, chúng tơi tiến hành phân tích chất chuẩn kiểm chứng QC có nồng độ chính xác 2,3,7,8-TCDD 5 pg/ml.
Để dựng đƣờng chuẩn, tiến hành pha các dung dịch chuẩn từ dung dịch chuẩn gốc D48-DM, nồng độ các dung dịch chuẩn tại các điểm chuẩn đƣợc trình bày trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Nồng độ các dung dịch chuẩn dựng đường chuẩn
Chất chuẩn
Nồng độ ( ng/ml )
STD0 STD1 STD2 STD3 STD4 STD5 STD6 STD7 STD8 STD9
2,3,7,8-TCDD 25.0 12.5 6.25 3.13 1.56 0.781 0.391 0.195 0.0997 0.0488
Trên cơ sở đó, chúng tơi đã tiến hành dựng đƣờng chuẩn cho phép phân tích, kết quả đƣợc mơ tả trong hình 3.1.