3.2.1. Tạo vector tái tổ hợp pEtM-Pwo
Mk 1kb Pwo 2344bp 2kb 1kb 250bp 3kb a- 1 2 Mk 1kb b- 1 2 3 4 5
Hình 10: Khuếch đại gen mã hóa Pwo-pol và xử lý enzyme cắt giới hạn
Kết quả điện di trên gel agarose 1%, a- sản phẩm PCR nhân dịng gen mã hóa Pwo DNA polymerase sử dụng cặp mồi chứa vị trí cắt enzyme giới hạn, marker 1kb của hãng iNtRon (đường chạy 1) được sử dụng để so sánh kích thước của gen Pwo khuếch đại (đường chạy 2); b- Sản phẩm cắt đồng thời plasmid pEtM (đường chạy 1;2) và gen mã hóa Pwo DNA pol (đường chạy 4;5) bằng hai enzyme cắt giới hạn EcoRI và BamHI so sánh với marker 1 kb của hãng iNtRon (đường chạy 3).
Kết quả điện di sản phẩm PCR (hình 10a) cho thấy đã nhân dịng chính xác được đoạn gen mã hóa Pwo DNA polymerase. Sản phẩm nhân gen thể hiện một băng sáng rõ có kích thước khoảng 2344 bp theo lý thuyết. Tuy nhiên, kết quả PCR cũng cho thấy một số băng phụ phía trên băng chính (khoảng 4-5 kb). Vì vậy, sản phẩm PCR đã được thơi gel trước khi sử dụng cho phản ứng cắt enzyme giới hạn.
Tiếp tục đánh giá kết quả kiểm tra cắt gen và plasmid với cả 2 enzyme cắt giới hạn EcoRI và BamHI được điện di trên gel agarose 1% (hình 10b). Plasmid pEtM trước khi cắt bao gồm các băng chính sáng rõ tương ứng với các dạng của plasmid (xoắn, vòng và siêu xoắn). Plasmid sau khi cắt với enzyme giới hạn thu được 1 băng sáng với kích thước khoảng 6 kb tương ứng với kích thước được mở vịng. Do đó, enzyme đã cắt chính xác tại các vị trí cắt giới hạn mong muốn trên vector biểu hiện. Tuy nhiên plasmid có thể chưa được cắt hồn toàn do vẫn quan sát thấy một băng mờ ở phía dưới băng plasmid cắt (đường chạy 1). Mặt khác, đoạn gen trước và sau khi cắt đã thu được kích thước bằng nhau từ kết quả điện di này. Điều này chứng tỏ đoạn gen đã được cắt đúng vị trí cắt giới hạn ở 2 đầu, cũng như
đoạn gen khơng chứa vị trí cắt bên trong. Vì vậy có thể tiến hành phản ứng nối bình thường cho gen và plasmid, tạo plasmid tái tổ hợp pEtM-Pwo.
3.2.2. Biến nạp vector tái tổ hợp pEtM-Pwo vào vi khuẩn E. coli BL21 (DE3)
a- 1kb Mk 1Kb Clone 1 Clone 2 Clone 3 2599 bp 266 bp 1 2 3 4 2kb 250bp 3kb b-
Hình 11: Biến nạp, ni cấy, chọn lọc plasmid tái tổ hợp pEtM-Pwo
a- Tế bào khả biến E. coli BL21 (DE3) bổ sung plasmid tái tổ hợp pEtM-Pwo cấy trải trên đĩa thạch bổ sung ampicilin. b- Kết quả điện di trên gel agarose 1% sản phẩm PCR chọn lọc khuẩn lạc chứa plasmid tái tổ hợp pEtM-Pwo, marker 1kb của hãng iNtRon (đường chạy 1) được sử dụng để so sánh kích thước của đoạn gen khuếch đại bằng cặp mồi T7 từ 3 khuẩn lạc tương ứng (đường chạy 2; 3; 4).
Đĩa thạch nuôi cấy tế bào khả biến có xuất hiện nhiều khuẩn lạc mọc cách đều nhau như hình 11a. Như vậy, đã biến nạp thành cơng hỗn hợp plasmid tái tổ hợp vào vi khuẩn E. coli. Kết quả biến nạp là đáng tin cậy khi đã được so sánh với đĩa đối chứng không bổ sung hỗn hợp plasmid tái tổ hợp, không quan sát thấy khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch. Như vậy tế bào khả biến sử dụng trong q trình biến nạp khơng bị nhiễm gen hoặc plasmid kháng kháng sinh.
Tuy nhiên khuẩn lạc mọc trên đĩa nuôi cấy bổ sung kháng sinh ampicilin (10 µg/ml) có thể xảy ra 2 trường hợp: (1) chứa plasmid tái tổ hợp hoặc (2) chứa plasmid chưa cắt hoàn toàn từ hỗn hợp sản phẩm cắt và nối enzyme giới hạn ở trên. Do đó, tiến hành chọn lựa 3 khuẩn lạc từ đĩa nuôi cấy, các khuẩn lạc mọc riêng rẽ, to, tròn đều sẽ được đem PCR kiểm tra hiệu suất chèn gen của phản ứng cắt nối.
Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra khuẩn lạc được chọn cho thấy, khuẩn lạc số 2 và 3 có mang plasmid tái tổ hợp được chèn thành cơng đoạn gen mã hóa Pwo-pol (hình 11b). Sản phẩm PCR từ hai khuẩn lạc này xuất hiện các băng có
với lý thuyết đoạn gen đích được nhân lên từ cặp mồi T7 cho kích thước là 2599 bp. Trong khi đó, khuẩn lạc số 1 mang plamid chưa chèn thành cơng đoạn gen đích, với cặp mồi T7 chỉ nhân lên sản phẩm PCR với kích thước khoảng hơn 250 bp.
3.2.3. Tách plasmid, kiểm tra trình tự
Nồng độ plasmid Stock x50 x100 pEtM Pwo 2599bp 2kb 1kb 500bp 4kb 6kb (-) 1 2 3 4 5 6 Mk 1kb
Hình 12: Tách chiết và kiểm tra plasmid tái tổ hợp
Kết quả điện di trên gel agarose 1% plasmid tái tổ hợp pEtM-Pwo sau khi tách chiết (đường chạy 2) và đoạn gen đích được khuếch đại bằng cặp mồi T7 với các nồng độ khuôn plasmid khác nhau (đường chạy 3; 4; 5), đối chứng âm là phản ứng không bổ sung khuôn plasmid (đường chạy 6). Kích thước được so sánh với marker 1 kb của iNtRon (đường chạy 1)
Plasmid tái tổ hợp thu được theo như kết quả điện di bao gồm hai băng rõ nét có kích thước khoảng 3 kb tương ứng với dạng siêu xoắn và 8 kb tương ứng với dạng vịng của plasmid. Các kích thước của plasmid thu được hồn tồn phù hợp với lý thuyết sau khi chèn thành cơng đoạn gen mã hóa Pwo-pol hơn 2 kb vào vector pEtM có kích thước khoảng 6 kb. Vì vậy, chúng tơi đã tách chiết thành công, thu được plasmid tái tổ hợp pEtM-Pwo.
Plasmid tái tổ hợp thu được đã được chèn gen chính xác bởi phản ứng kiểm tra PCR bằng cặp mồi T7. Với cả 3 nồng độ khuôn plasmid sử dụng trong phản ứng PCR đều cho kết quả là một băng điện di duy nhất có kích thước khoảng 2599 bp theo lý thuyết. Kết quả PCR kiểm tra là đáng tin cậy khi so sánh với đối chứng âm không lên băng tương ứng.
Do đó, sản phẩm PCR thu được từ thí nghiệm có băng sáng rõ, khơng chứa băng phụ đã được tinh sạch và gửi giải trình tự. Kết quả kiểm tra sự ghép nối chính xác gen Pwo vào khung đọc mở chứa đi 6xHis-tag và trình tự cắt thrombin của
plasmid pEtM như phân tích bên dưới. Dữ liệu phân tích trình tự acid amin này cho thấy khơng có sự xuất hiện của các đột biến thay thế hoặc chèn sai khung đọc mở của đoạn gen đích trong q trình nhân dịng và biến nạp.
P.woesei ---------------MILDVDYITEEGKPVIRLFKKENGKFKIEHDRTFRPYIYALLRDD Pwo-tái tổ hợp MHHHHHHSSGLVPRGSILDVDYITEEGKPVIRLFKKENGKFKIEHDRTFRPYIYALLRDD ******************************************** P.woesei SKIEEVKKITGERHGKIVRIVDVEKVEKKFLGKPITVWKLYLEHPQDVPTIREKVREHPA Pwo-tái tổ hợp SKIEEVKKITGERHGKIVRIVDVEKVEKKFLGKPITVWKLYLEHPQDVPTIREKVREHPA ************************************************************ P.woesei VVDIFEYDIPFAKRYLIDKGLIPMEGEEELKILAFDIETLYHEGEEFGKGPIIMISYADE Pwo-tái tổ hợp VVDIFEYDIPFAKRYLIDKGLIPMEGEEELKILAFDIETLYHEGEEFGKGPIIMISYADE ************************************************************ P.woesei NEAKVITWKNIDLPYVEVVSSEREMIKRFLRIIREKDPDIIVTYNGDSFDFPYLAKRAEK Pwo-tái tổ hợp NEAKVITWKNIDLPYVEVVSSEREMIKRFLRIIREKDPDIIVTYNGDSFDFPYLAKRAEK ************************************************************ P.woesei LGIKLTIGRDGSEPKMQRIGDMTAVEVKGRIHFDLYHVITRTINLPTYTLEAVYEAIFGK Pwo-tái tổ hợp LGIKLTIGRDGSEPKMQRIGDMTAVEVKGRIHFDLYHVITRTINLPTYTLEAVYEAIFGK ************************************************************ P.woesei PKEKVYADEIAKAWESGENLERVAKYSMEDAKATYELGKEFLPMEIQLSRLVGQPLWDVS Pwo-tái tổ hợp PKEKVYADEIAKAWESGENLERVAKYSMEDAKATYELGKEFLPMEIQLSRLVGQPLWDVS ************************************************************ P.woesei RSSTGNLVEWFLLRKAYERNEVAPNKPSEEEYQRRLRESYTGGFVKEPEKGLWENIVYLD Pwo-tái tổ hợp RSSTGNLVEWFLLRKAYERNEVAPNKPSEEEYQRRLRESYTGGFVKEPEKGLWENIVYLD ************************************************************ P.woesei FRALYPSIIITHNVSPDTLNLEGCKNYDIAPQVGHKFCKDIPGFIPSLLGHLLEERQKIK Pwo-tái tổ hợp FRALYPSIIITHNVSPDTLNLEGCKNYDIAPQVGHKFCKDIPGFIPSLLGHLLEERQKIK ************************************************************ P.woesei TKMKETQDPIEKILLDYRQKAIKLLANSFYGYYGYAKARWYCKECAESVTAWGRKYIELV Pwo-tái tổ hợp TKMKETQDPIEKILLDYRQKAIKLLANSFYGYYGYAKARWYCKECAESVTAWGRKYIELV ************************************************************ P.woesei WKELEEKFGFKVLYIDTDGLYATIPGGESEEIKKKALEFVKYINSKLPGLLELEYEGFYK Pwo-tái tổ hợp WKELEEKFGFKVLYIDTDGLYATIPGGESEEIKKKALEFVKYINSKLPGLLELEYEGFYK ************************************************************ P.woesei RGFFVTKKRYAVIDEEGKVITRGLEIVRRDWSEIAKETQARVLETILKHGDVEEAVRIVK Pwo-tái tổ hợp RGFFVTKKRYAVIDEEGKVITRGLEIVRRDWSEIAKETQARVLETILKHGDVEEAVRIVK ************************************************************ P.woesei EVIQKLANYEIPPEKLAIYEQITRPLHEYKAIGPHVAVAKKLAAKGVKIKPGMVIGYIVL Pwo-tái tổ hợp EVIQKLANYEIPPEKLAIYEQITRPLHEYKAIGPHVAVAKKLAAKGVKIKPGMVIGYIVL ************************************************************ P.woesei RGDGPISNRAILAEEYDPKKHKYDAEYYIENQVLPAVLRILEGFGYRKEDLRYQKTRQVG Pwo-tái tổ hợp RGDGPISNRAILAEEYDPKKHKYDAEYYIENQVLPAVLRILEGFGYRKEDLRYQKTRQVG ************************************************************ P.woesei LTSWLNIKKS Pwo-tái tổ hợp LTSWLNIKKS **********
Hình 13: So sánh trình tự amino acid của gen mã hóa Pwo DNA polymerase Các trình tự amino acid kí hiệu P. woesei (tương ứng cho Pwo-pol trong tự nhiên) và Pwo- Các trình tự amino acid kí hiệu P. woesei (tương ứng cho Pwo-pol trong tự nhiên) và Pwo-
tái tổ hợp (tương ứng trong thí nghiệm) được dóng hàng bằng phần mềm ClustalW online.
Đuôi peptide chứa 6 histidine (màu đỏ), và trình tự cắt gồm 6 acid amin của thrombin (màu xanh). Dấu “*” thể hiện sự tương đồng giữa các acid amin của hai trình tự.
3.3. Biểu hiện protein Pwo DNA polymerase ở vi khuẩn E. coli 1 2 3 4 5