a- Quy trình tinh sạch sắc ký ái lực sử dụng máy siêu âm phá vỡ tế bào, đường chạy 1: marker protein, đường chạy 2; 3 lần lượt là mẫu đối chứng khơng có IPTG và mẫu biểu hiện IPTG 0.3 mM, đường chạy 4; 5 lần lượt là cặn và dịch siêu âm phá vỡ tế bào, đường chạy 6: dịch qua cột sau khi ủ mẫu với nickel, đường chạy 7: dịch tinh sạch chứa protein Pwo-pol. b- Tối ưu quy trình tinh sạch hình a bằng cách tăng nồng độ imidazol trong đệm rửa, đường chạy 1: marker protein, đường chạy 2; 3; 4; tương ứng là đệm rửa 1 (30 mM imidazole), đệm rửa 2 (60 mM imidazole), đệm rửa 3 (100 mM imidazole), đường chạy 5: mẫu được tinh sạch sau khi sử dụng cả 3 loại đêm rửa. Các mẫu protein được điên di trên gel SDS-PAGE 10%, 120V, 90 phút.
Kết quả điện di quy trình tinh sạch sắc ký ái lực sử dụng máy siêu âm phá vỡ tế bào (hình 16a) chỉ ra mẫu sử dụng trong tinh sạch là mẫu biểu hiện IPTG 0.3 mM. Trong đó, băng protein biểu hiện có kích thước khoảng 92 kDa chỉ có ở mẫu biểu hiện khi so sánh với mẫu đối chứng. Thêm vào đó, lượng protein Pwo-pol vẫn cịn nhiều trong cặn phá vỡ bằng máy siêu âm khi so sánh với dịch phá vỡ thu được. Do đó, cần tiếp tục tối ưu quá trình phá vỡ tế bào để hiệu suất protein tái tổ hợp thu được cao hơn. Dịch tinh sạch protein tái tổ hợp thu được có độ tinh sạch kém. Hầu hết các protein của E. coli vẫn chưa được loại bỏ, chỉ một lượng nhỏ protein khơng bám với nickel đã đi qua cột. Vì vậy, các protein tạp này có thể có khả năng liên kết với nickel nên cần tối ưu thêm bước rửa như tăng nồng độ imidazole trong đệm rửa.
Kết quả tối ưu bước rửa các protein tạp của E. coli trong phương pháp tinh
sạch với cột sắc lý ái lực (hình 16b) khơng đạt hiệu quả như mong muốn. Khi tăng nồng độ imdazole trong dung dịch đệm rửa từ 30 mM lên 60mM và 100mM, lượng protein tái tổ hợp đã bị rửa trôi nhiều hơn. Trong khi đó, lượng protein tạp bị rửa trơi khơng đáng kể. Điều này chứng tỏ có khả năng các protein đã liên kết với nhau
và liên kết với protein tái tổ hợp. Vì vậy, chúng đã được giữ lại trên cột cùng với protein tái tổ hợp.
b. Sử dụng mẫu tế bào biểu hiện được phá vỡ bằng sóng siêu âm kết hợp xử lý ở nhiệt độ 70oC Mk 26 42 55 72 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 kDa 92 kDa