PCR sử dụng buffer có nồng độ KCl là 250 mM. Các thành phần khác của buffer PCR bao gồm 200 mM Tris-HCl pH 8.8, 100 mM (NH4)2SO4, 20 mM MgSO4, 1% Triton X, 1 mg/ml BSA. Đường chạy 1: marker iNtRon, đường chạy 2; 3; 4; 5; 6 tương ứng với các nồng độ giảm dần của protein Pwo-pol tinh sạch theo phương pháp sắc ký ái lực sau khi xử lý với nhiệt độ 95oC từ 2 – 0.4 mg/ml. Kết quả điện di trên gel agarose 1%, 100V, 15 phút.
Muối KCl là thành phần quan trọng giúp ổn đinh DNA polymerase trong q trình kéo dài, tuy nhiên chúng có thể làm giảm khả năng biến tính của DNA. Tăng nồng độ KCl giúp làm tăng lượng sản phẩm PCR cho kích thước đoạn gen ngắn khoảng 400 bp (hình 21). Kết quả này cũng đánh giá một phần ảnh hưởng của nồng độ protein thử hoạt tính đến độ sáng băng sản phẩm PCR. Với buffer PCR bao gồm 100 mM KCl, độ sáng băng giảm khi nồng độ enzyme dưới 0.8 mg/ml. Trong khi đó, với buffer bao gồm 250 mM KCl thu được kết quả các sản phẩm PCR có độ sáng tương đương nhau ở các nồng độ protein khác nhau. Điều này cho thấy KCl đã giúp làm tăng hoạt độ của protein Pwo-pol tái tổ hợp.
3.5.2. Hoạt tính sao chép
Bên cạnh việc so sánh nồng độ, độ tinh sạch của protein tái tổ hợp bằng điện di gel SDS-PAGE, cũng cần đảm bảo sau mỗi phương pháp tinh sạch thì protein tái
tổ hợp thu được có hoạt tính ổn định, khơng bị biến tính hay bị ảnh hưởng bởi các thành phần hóa chất từ phương pháp tinh sạch.
Mk 1kb i-Taq 0.5 ul Pwo (1) 0.5 ul i-Taq 0.2 ul Pwo (1) 0.2 ul 1kb 500bp 250bp 2kb 1 2 3 4 5
a- 100bpMk Pwo (1)0.5 ul Pwo (2)1 ul Pwo (2)1 ul Pwo (2)0.5 ul Pwo (2)0.25 ul
1 2 3 4 5 6 400bp b- 1kb 500bp 100bp