2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.2. Nhân dịng, tạo vector mang gen mã hóa Pwo DNA polymerase
Vector tổng hợp PUC19-Pwo (Sản phẩm PCR) 5’-ggatcc-Gen Pwo-gaattc-3’ (1) PCR BamHI/EcoRI primers Điện di DNA pEtM (5453bp) Restriction enzyme Ligase Điện di sản phẩm cắt nối
(2) Tạo vector tái tổ hợp pEtM-Pwo
(3) Biến nạp BL21 (DE3)
(4) Tách plasmid pEtM-Pwo
Điện di plasmid Bảo quản
(5) Giải trình tự Kiểm tra khung đọc
(1) PCR nhân gen Pwo DNA polymerase
Gen mã hóa Pwo DNA polymerase được khuếch đại bằng phương pháp PCR sử dụng khuôn plasmid PUC19-Pwo nhận từ công ty TNHH MTV Sinh Hóa Phù Sa (PHUSA Biochem). Tiến hành phản ứng PCR theo thành phần như trong bảng 7. Chu trình nhiệt độ cho phản ứng lần lượt với giai đoạn biến tính ban đầu 98oC/2 phút; 35 chu kỳ lặp lại của các bước biến tính 98oC/30 giây, gắn mồi 60oC/15 giây, kéo dài 72oC/1 phút; giai đoạn kéo dài cuối cùng 72oC/5 phút.
Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%, chạy điện đi 100V, 30 phút. Bản gel được ngâm trong dung dịch chứa thuốc nhuộm ethidium bromide (EtBr), soi gel dưới đèn UV và chụp ảnh bởi hệ thống camera AlphaImager MINI (của Mỹ).
Bảng 7: Thành phần phản ứng PCR nhân dịng gen mã hóa Pwo-pol
Thành phần phản ứng Nồng độ Thể tích (µl) H2O pcr 34 Pwo-BamHI 10 µM 1.5 Pwo-EcoRI 10 µM 1.5 GC buffer 5X 10 dNTPs 10 mM 1
Phusion (Thermo) 2 U/µl 0.5
Khn PUC19-Pwo 10 ng/µl 1.5
Σ 50
(2) Tạo plasmid tái tổ hợp pEtM-Pwo
Sản phẩm PCR đem thôi gel sử dụng bộ kit thôi gel/tinh sạch MEGAquick- spin™ Total Fragment DNA Purification Kit của hãng iNtRon (Hàn Quốc) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Quy trình: tra tồn bộ thể tích sản phẩm PCR điện di trên gel agarose 1%, chạy điện di 100V, 30 phút. Cắt lấy băng đúng kích thước khoảng 2344 bp theo lý thuyết. Mảnh gel cắt ra có khối lượng khơng q 0.3 g đem ủ với 500 µl dung dịch đệm BNL, ở 56oC khoảng 10 phút. Trong thời gian ủ, cứ 3 phút đảo hỗn hợp một lần cho đến khi mảnh gel tan hoàn toàn. Hỗn hợp đồng nhất thu được chuyển lên cột, ly tâm 11000g/30s, đổ bỏ dịch qua cột. Bổ sung 700 µl dung dịch đệm Wash để rửa các thành phần muối trong dung dịch đệm BNL còn bám trên cột, ly tâm
11000g/30s, đổ bỏ dịch rửa qua cột. Cột đem ly tâm khô ở tốc độ cao hơn 15000g/3’ để loại bỏ hồn tồn cồn có trong dung dịch đệm rửa. Chuyển cột sang ống epp 1.5 ml mới, ủ lên màng cột 40 µl nước deion khoảng 5-10’, đem ly tâm 15000 g/1 phút. Dung dịch trong ống epp chứa DNA và plasmid đã tinh sạch, được bảo quản và sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo.
Sản phẩm tinh sạch chứa đoạn gen đích và vector pEtM được xử lý với enzyme cắt giới hạn theo thành phần liệt kê trong bảng 8, hỗn hợp được ủ ở 37oC liên tục trong 2 tiếng, để thu được sản phẩm cắt hồn tồn. Sau đó tiếp tục tinh sạch theo quy trình của bộ kít thơi gel/tinh sạch MEGAquick-spin™ Total Fragment DNA Purification Kit (iNtRon). Mẫu tinh sạch bao gồm 30 µl gen mã hóa Pwo DNA polymerase và 30 µl plasmid (V) được trộn đều với 300 µl BNL buffer (5V), rồi đưa hỗn hợp lên cột. Thu hồi hỗn hợp DNA và plasmid với 40 µl nước PCR trước khi đem sử dụng cho phản ứng nối như bên dưới:
Bảng 8: Thành phần phản ứng cắt, nối gen và plasmid
Phản ứng cắt Pwo-DNA (V-µl) pEtM-Plasmid (V-µl) Phản ứng nối Thể tích (µL) H2O 23,5 31 T4 ligase 16
Fast Digest Buffer (10X) 4 4 Ligate buffer (10X) 2 DNA/Plasmid 10 3 DNA+Plasmid 2 BamHI 1 1 EcoRI 1,5 1 Σ 40 40 20
Phản ứng nối diễn ra ở nhiệt độ phòng. Nên sau khi trộn đều các dung dịch, ủ ống hỗn hợp ở nhiệt độ phòng (30oC) khoảng 2 tiếng. Sản phẩm sau khi nối được biến nạp ngay vào tế bào vi khuẩn E. coli.
(3) Biến nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli BL21 (DE3)
Quy trình biến nạp sử dụng tế bào khả biến E. coli chủng BL21 (DE3), các
thao tác được thực hiện trong tủ an toàn sinh học và làm sạch bề mặt khu vực trước khi thao tác bằng cồn 70o.
Chuẩn bị tế bào: lấy ống tế bào khả biến (100 µl) được bảo quản trong ni tơ lỏng, để giã đơng trên đá khoảng 20 phút. Chia 50 µl tế bào khả biến vào ống epp 1.5 ml đã được bổ sung thêm 20 µl sản phẩm nối DNA và plasmid, ủ hỗn hợp trên đá 20 phút. Đem cả 2 ống tế bào sốc nhiệt ở 42oC/1 phút, lấy tế bào ra đặt trên đá 5
phút. Tiếp tục bổ sung vào 2 ống 600 µl LB lỏng, ni tĩnh ở 37oC/15 phút. Khi các tế bào biến nạp đã ổn định thì chuyển các ống sang nuôi lắc ở 37oC/30 phút để tế bào sinh trường.
Chuẩn bị đĩa thạch: môi trường LB agar, đĩa cấy đem khử trùng trước khi sử dụng. Quay mơi trường trong lị vi sóng đến khi dung dịch đồng nhất, lấy 30 ml LB agar để nguội khoảng 40-50oC, bổ sung 30 µl ampicillin (100 mg/ml). Lắc đều dung dịch, sau đó chia ra 2 đĩa cấy (15 ml/đĩa), để đơng khoảng 10 phút ở nhiệt độ phịng.
Biến nạp: đem 2 ống tế bào ly tâm nhẹ khoảng 6000 rpm/phút trong 2 phút ở
nhiệt độ phịng để loại bớt khoảng 500 µl dịch ni cấy. Lượng dịch và vi khuẩn cịn lại trong ống trộn đều đem tồn bộ cấy trải trên đĩa thạch đã chuẩn bị. Đĩa thạch nuôi cấy đem ủ 37oC qua đêm (16-18 tiếng).
(4) Tách dòng plasmid tái tổ hợp pEtM-Pwo
PCR kiểm tra khuẩn lạc chứa plasmid tái tổ hợp pEtM-Pwo mọc lên từ đĩa nuôi cấy chọn lọc bằng kháng sinh ampicilin. Chọn lọc 3-5 khuẩn lạc to, tròn đều đem PCR kiểm tra, sử dụng cặp mồi T7 nằm ở 2 đầu của đoạn gen đích, T7- promoter cách bộ ba mở đầu 23 aa, T7-terminator cách bộ ba kết thúc 40 aa. Thành phần phản ứng PCR và chu trình nhiệt độ tiến hành như phản ứng PCR nhân gen Pwo DNA polymerase, nhiệt độ gắn mồi được tối ưu cho cặp mồi T7 là 55oC.
Điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 1%, chạy điện di 100 V, 30 phút. Theo lý thuyết, nếu khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp sẽ cho sản phẩm PCR chứa đoạn gen có kích thước 2599 bp. Ngược lại nếu khuẩn lạc chứa vector không chèn gen thành công sẽ cho sản phẩm PCR có kích thước 266 bp. Như vậy, sau khi đã sàng lọc được khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp chèn gen thành công, đem nuôi cấy và tách chiết plasmid.
Tách chiết plasmid tái tổ hợp pEtM-Pwo sử dụng bộ kit Thermo Science GeneJET Plasmid Miniprep Kit theo quy trình hướng dẫn của nhà sản xuất.
Quy trình: 5ml dịch nuôi cấy đem ly tâm 13000 rpm/2 phút, ở nhiệt độ
phịng. Đổ bỏ dịch ni cấy, thu cặn tế bào, bổ sung thêm 250 µl dung dịch đệm Resuspension (có RNase), sau đó vortex cho tan cặn. Hỗn hợp dung dịch thu được tiếp tục bổ sung 250 µl dung dịch đệm Lysis, đảo đều 4-6 lần hoặc vortex nhanh cho dung dịch đồng nhất. Tiếp theo, bổ sung 350 µl dung dịch đệm Neutralization, chú ý chỉ đảo đều 4-6 lần không vortex dung dịch tránh đứt gãy DNA. Lúc này,
dịch ly giải tế bào được cân bằng xuất hiện vẩn đục trắng đem ly tâm 13000 rpm/5 phút, ở nhiệt độ phịng. Thu lại phần dịch trong có chứa plasmid đưa lên cột, rồi ly tâm 13000 rpm/1 phút. Cột tinh sạch được rửa với 500 µl đệm Wash để loại bỏ các hóa chất thừa, muối, protein từ các bước tinh sạch trước đó. Trước khi thu lại plasmid cần ly tâm khô khoảng 13000 rpm/3 phút. Chuyển cột sang ống epp 1.5 ml mới, thêm 50 µl Elution, ủ 5-10 phút ở nhiệt độ phòng rồi ly tâm 13000 rpm/2 phút. Plasmid tái tổ hợp thu được đem bảo quản ở -20oC cho các thí nghiệm tiếp theo.
(5) Giải trình tự kiểm tra khung đọc
Plasmid tái tổ hợp thu được sau quá trình tách chiết đem pha loãng từ 50-100 lần để sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR giải trình tự. Thực hiện phản ứng PCR với khuôn plasmid sử dụng cặp mồi T7 tương tự như phản ứng PCR kiểm tra khuẩn lạc mục (5).
Sản phẩm PCR được tinh sạch sử dụng bộ kít thơi gel/tinh sạch MEGAquick-spin™ Total Fragment DNA Purification Kit (iNtRon) tương tự quá trình tinh sạch sản phẩm cắt enzyme giới hạn ở bước trên. Mẫu tinh sạch đem gửi và giải trình tự bởi cơng ty 1st base, Malaysia theo phương pháp Sanger, ứng dụng bộ kít BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit với hệ thống phân tích ABI PRISM® 3100-Avant Genetic Analyzer.
Kết quả giải trình tự sẽ được xử lý cắt bỏ phần nhiễu ở hai đầu, chú ý phần đầu T7-promoter cần phải đọc được ít nhất bắt đầu từ đuôi 6xHis, và vị trí cắt thrombin để chắc chắn trình tự được chèn đúng khung đọc mở. Các đoạn trình tự sau đó được ghép nối dựa trên các vùng chồng gối lên nhau.
Bảng 9: Trình tự các cặp mồi giải trình tự STT Tên Trình tự (5'-3') Độ dài Tm STT Tên Trình tự (5'-3') Độ dài Tm 1 T7-Promoter TAATACGACTCACTATAGGG 20 bp 50.32 2 T7-Terminator TGCTAGTTATTGCTCAGCGG 20 bp 58.06 3 iPwo-F GACCTATACCCTGGAAGCGG 20 bp 59.52 4 iPwo-R AATATATTTGCGGCCCCACG 20 bp 58.76
Do kích thước của đoạn gen Pwo DNA polymerase có thêm vùng T7 ở hai đầu, lớn hơn 2500 bp, nên chúng tôi cần 2 cặp mồi như bảng 9 để giải được toàn bộ đoạn gen.