Đường chạy 1: marker protein, đường chạy 2; 3 lần lượt là mẫu đối chứng khơng có IPTG và mẫu biểu hiện IPTG 0.3 mM, đường chạy 4; 5 lần lượt là cặn và dịch siêu âm phá vỡ tế bào xử lý với nhiệt độ 95oC, đường chạy 6: dịch qua cột sau khi ủ mẫu với nickel, đường chạy 7: dịch tinh sạch chứa protein Pwo-pol, đường chạy 8: rửa cột với nước. Các mẫu protein được điên di trên gel SDS-PAGE 10%, 120V, 90 phút.
Quá trình xử lý mẫu với nhiệt độ cao lên đến 95% đã mang lại hiệu quả khi loại bỏ phần lớn protein tạp của vi khuẩn E. coli. Như kết quả điện di hình 18, phần lớn protein Pwo-pol đã nằm trong pha dịch. Độ tinh sạch của mẫu protein thu được khá cao, hiệu suất thu hồi protein tái tổ hợp đạt trên 50%. Bên cạnh đó, tế bào biểu hiện khi được xử lý với nhiệt độ cao 95oC trong thời gian 30 phút cũng dễ dàng giải phóng protein Pwo-pol mà khơng cần tiến hành bước siêu âm phá vỡ tế bào. Đây là một trong những điều kiện giúp có thể tinh sạch protein Pwo-pol tái tổ hợp nhanh chóng và dễ dàng hơn.
Mặc dù đã tiến hành đun nóng tế bào ở nhiệt độ 95oC liên tục trong 30 phút nhưng vẫn khơng thể loại bỏ hồn toàn các protein tạp khác. Vấn đề tồn tại này trong quá trình tinh sạch protein DNA polymerase được cho là có sự tương tác giữa các protein tham gia vào bộ máy sao chép DNA cũng như sự liên kết giữa chúng với các protein khác [27]. Do đó, khi protein Pwo-pol được giữ lại trên cột thì các protein này cũng được giữ lại. Vì vậy, cách giải quyết có thể sử dụng một số muối có khả năng gây biến tính tạm thời cho protein, làm giảm khả năng liên kết giữa chúng. Một số nghiên cứu trước đây đã sử dụng muối ammonium sulfate (AS) để tinh sạch với Taq-pol hoặc Pfu-pol và thu được những kết quả tốt.
3.4.2. Phương pháp tinh sạch kết tủa bằng muối ammonium sulfate
Tinh sạch protein Pwo DNA polymerase bằng phương pháp kết tủa AS được thực hiện nhằm khắc phục vấn đề chưa tinh sạch được protein bằng phương pháp cột sắc ký ái lực Nickel-resin. 72 55 42 26 17 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Dịch siêu âm tủa (NH4)2SO4 Dịch sucrose tủa (NH4)2SO4
Mk
20% 30% 40% 50% 60% 60% 50% 40% 30% 20%
92 kDa