Hàng trên: Sản phẩm nhân gen kích thước nhỏ của các protein Pwo-pol tái tổ hợp từ phương pháp tinh sạch sắc ký ái lực. Hàng dưới: Sản phẩm nhân gen kích thước lớn của các protein Pwo-pol tái tổ hợp từ phương pháp tinh sạch sắc ký ái lực. Các protein theo thứ tự lần lượt là Pwo-pol tinh sạch sắc ký ái lực, Pwo-pol tinh sạch sắc ký ái lực sau khi xử lý ở nhiệt độ 70oC, Pwo-pol tinh sạch sắc ký ái lực sau khi xử lý ở nhiệt độ 95oC. Đường chay 1: marker iNtRon, đường chạy 2; 3; 4: phản ứng PCR với buffer pH 7.5, đường chạy 5; 6; 7: phản ứng PCR với buffer pH 8.0, đường chạy 8; 9; 10: phản ứng PCR với buffer pH 8.8. Kết quả điện di trên gel agrose 1%, 100V, 30 phút.
Theo các nghiên cứu trước đây, pH là một trong những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến khả năng hoạt động của mỗi loại enzyme DNA-pol. Thông thường các enzyme nhóm DNA-polB có hoạt động tốt trong dải pH từ 8.0 – 9.0 [22]. Do đó, chúng tơi đã thử hoạt tính của enzyme với 3 loại buffer PCR có pH lần lượt là 7.5; 8.0; và 8.8. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gen AcrH như hình 20 cho thấy protein Pwo-pol tinh sạch bằng quy trình sắc ký ái lực chỉ có hoạt tính ở 10X buffer, pH 8.0. Trong khi đó, cả 2 protein Pwo-pol được tinh sạch bằng quy trình sắc ký ái lực đã xử lý với nhiệt độ cao lại có phản ứng ổn định ở cả 3 loại buffer với pH khác nhau. Do đó, có thể mức độ tinh sạch của protein tái tổ hợp đã ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme trong điều kiện pH chưa tối ưu
Chúng tôi tiếp tục so sánh kết quả điện di sản phẩm PCR có kích thước lớn hơn (> 2 kb), chỉ có protein Pwo-pol tinh sạch bằng quy trình sắc ký ái lực đã xử lý với nhiệt độ 95oC. Và protein này có độ tinh sạch tốt nhất nên đã cho hoạt tính ổn định nhất với cả kích thước nhỏ và kích thước lớn. Tuy nhiên băng chính của sản
phẩm PCR kích thước lớn nhân được khơng sáng rõ như sản phẩm PCR kích thước nhỏ mờ, và cịn có thêm một số băng phụ. Vì vậy, chúng tơi tiếp tục tối ưu một yếu tố khác là nồng độ KCl cho buffer PCR với pH 8.8, ptrong điều kiện giảm nồng độ khn mẫu. Mk 100mM KCl 250mM KCl 400bp 400bp 1 2 3 4 5 6
Hình 21: Ảnh hưởng của nồng độ KCl đến khả năng khuếch đại đoạn gen ngắn Hàng trên: phản ứng PCR sử dụng buffer có nồng độ KCl là 100 mM, hàng dưới phản ứng