kỹ thuật đƣợc sử dụng phổ biến tại nhiều quốc gia do các ƣu điểm nhanh, đơn giản, ít tốn kém, có thể sàng lọc đƣợc nhiều đột biến trong một phản ứng [42].
1.2 KỸ THUẬT ARMS-PCR (AMPLIFICATION REFRACTORY MUTATION SYSTEM - PCR) MUTATION SYSTEM - PCR)
1.2.1 Nguyên tắc của kỹ thuật ARMS-PCR
ARMS-PCR còn đƣợc gọi là PCR đặc hiệu allen (Allele-specific PCR- ASP) hay PCR khuếch đại allen đặc hiệu (PCR Amplification of Specific Alleles-PASA), đƣợc sử dụng hiệu quả trong việc phát hiện các đột biến
điểm. Đƣợc mô tả lần đầu tiên bởi Newton, kỹ thuật này sau đó đã đƣợc phát triển để phát hiện các đột biến β-thalassemia phổ biến ở tất cả các nhóm dân tộc [41,42].
Phƣơng pháp này dựa trên đặc tính DNA polymerase yêu cầu nucleotide ở đầu 3‟ của mồi bắt cặp bổ sung với nucleotide trên sợi khuôn. Nếu nucleotide đầu 3‟ của mồi không bổ sung với trình tự đích thì Taq polymerase không thể tổng hợp sợi mới đƣợc. Do đó, kỹ thuật này đòi hỏi nucleotide đầu 3‟ của mồi phải mang tính đặc hiệu [41]. Sơ đồ của kỹ thuật ARMS-PCR đƣợc trình bày ở Hình 1.4.
Hình 1.4. Sơ đồ kỹ thuật ARMS-PCR phát hiện đột biến điểm [67]. 1.2.2 Thiết kế mồi cho phản ứng ARMS-PCR
Mồi sử dụng cho một phản ứng ARMS-PCR bao gồm mồi bình thƣờng và mồi đột biến. Mồi bình thƣờng đặc hiệu cho trình tự ADN bình thƣờng, khơng khuếch đại đƣợc trình tự ADN đột biến và ngƣợc lại. Sự có mặt của đột biến đƣợc thể hiện bằng sản phẩm ADN đƣợc khuếch đại với các kích thƣớc đã biết trƣớc. Trong phản ứng ARMS-PCR cịn có một cặp mồi nội
chuẩn nhằm khuếch đại vùng gen đích khơng có đột biến để tránh trƣờng hợp âm tính giả do các nguyên nhân nhƣ: quá ít hoặc quá nhiều ADN, ADN chất lƣợng không tốt, khơng có mồi, khơng có Taq DNA polymerase hay các thành phần khác hoặc có mặt chất ức chế phản ứng PCR [35].
Sự nghiêm ngặt của điều kiện phản ứng có thể ảnh hƣởng tới độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng ARMS-PCR. Do đó, các yếu tố nhƣ thiết kế mồi tốt, nhiệt độ gắn mồi cao và số chu kì giới hạn rất quan trọng để cho kết quả chính xác. Nhiệt độ gắn mồi quá thấp hoặc số chu kì phản ứng quá cao, đều có thể dẫn tới kết quả dƣơng tính giả [35].
Việc thiết kế mồi bình thƣờng và mồi đột biến dựa trên các đặc điểm đƣợc trình bày ở Bảng 1.2.
Bảng 1.2. Đặc điểm các mồi bình thƣờng và mồi đột biến của phản ứng
ARMS-PCR [35]
Mồi bình thƣờng Mồi đột biến
- Dài khoảng 30 bp
- Thành phần G+C từ 40-60%
- Trình tự các nucleotide tại đầu 3‟ không bổ sung với mồi đột biến hoặc mồi nội chuẩn
- Khơng có trình tự nucleotide lặp lại để tránh hiện tƣợng bắt cặp nhầm.
- Dài khoảng 30 bp
- Nucleotide tận cùng đầu 3‟ của mồi bổ sung với nucleotide đích. Bắt cặp sai tại vị trí này làm giảm hiệu quả khuếch đại. Bắt cặp sai giữa các nucleotide A:G, G:A, C:C dẫn tới hiệu quả khuếch đại giảm nhiều nhất, trong khi các bắt cặp sai khác làm giảm khuếch đại ở các mức độ khác nhau
- Bổ sung thêm vị trí bắt cặp sai tại một trong 5 nucleotide cuối cùng của
mồi làm tăng tính đặc hiệu của sản phẩm.
1.2.3 Ƣu điểm và nhƣợc điểm của kỹ thuật ARMS-PCR
Kỹ thuật ARMS-PCR phù hợp để phát hiện các đột biến điểm, cho phép phân biệt giữa trình tự bình thƣờng, đột biến đồng hợp, dị hợp. Đây là kỹ thuật nhanh, ít tốn kém, khơng u cầu mồi phải đánh dấu và hệ thống phát hiện phức tạp [67].
Tuy vậy, kỹ thuật này chỉ có thể phát hiện đƣợc các đột biến đã biết và đa hình. Do đó, cần kết hợp với các phƣơng pháp chẩn đốn phân tử khác (ví dụ giải trình tự). Đối với phản ứng đơn ARMS-PCR, trong một lần thực hiện phản ứng chỉ có thể phát hiện đƣợc một đột biến, dẫn tới chi phí khá tốn kém. Để giải quyết vấn đề này, kỹ thuật multiplex ARMS-PCR đã đƣợc phát triển cho phép phát hiện nhiều đột biến trong cùng một phản ứng [67]. Kỹ thuật multiplex ARMS-PCR do sự kết hợp giữa multiplex PCR và ARMS-PCR, cho phép sử dụng đồng thời allen bình thƣờng và allen đột biến trong cùng một phản ứng để phát hiện trạng thái đồng hợp, dị hợp của các đột biến [51].
1.2.4 Kỹ thuật ARMS-PCR trong chẩn đoán bệnh β-thalassemia
Kỹ thuật ARMS-PCR đã đƣợc sử dụng trong nhiều nghiên cứu khác nhau để phát hiện đột biến trên gen β-globin. Tại Singapore, Tan và cs. đã sử dụng kỹ thuật ARMS-PCR để chẩn đoán trƣớc sinh sáu đột biến phổ biến gây bệnh β-thalassemia là -28 (A→G), IVS1.1 (G→T), IVS1.5 (G→C), Cd 17 (A→T), Cd 41/42 (-TCTT) và IVS2.654 (C→T) [59]. Kỹ thuật này cũng đã đƣợc áp dụng thành công để phát hiện các đột biến hiếm -29 (A→G), đột biến codon mở đầu ATG→AGG, Cd 8/9 (+G), CAP (+1) (A→C), đột biến đuôi poly A (A→G) của ngƣời Malay và Trung Quốc tại Malaysia [20]. Trong nghiên cứu năm 2001, Najmabadi và cs. đã thiết lập phƣơng pháp ARMS-
PCR để sàng lọc 10 đột biến β-thalassemia phổ biến nhất và HbS trên 82 bệnh nhân thể vừa và nặng tại Iran [40]. Tại Pakistan, năm 2009, kỹ thuật ARMS- PCR cũng đã đƣợc áp dụng để sàng lọc 5 đột biến phổ biến IVS1.1 (G→T), IVS1.5 (G→C), Cd 8/9 (+G), Cd 41/42 (-CTTT) và đột biến mất đoạn 619 bp [64].
Tại Việt Nam, Lý Thị Thanh Hà và cs. (2008) đã áp dụng kỹ thuật ARMS-PCR trong chẩn đoán trƣớc và sau sinh bệnh β-thalassemia tại bệnh viện Nhi Trung Uơng nhằm phát hiện các đột biến gen β-globin trên bệnh
nhân β-thalassemia. Kết quả đã đƣa ra tần suất của các đột biến thƣờng gặp và chẩn đốn trƣớc sinh cho thai phụ có nguy cơ sinh con bị β-thalassemia thể nặng [1]. Năm 2008, Nguyễn Khắc Hân Hoan và cs. đã xây dựng kỹ thuật multiplex ARMS-PCR ứng dụng vào chẩn đoán trƣớc sinh đột biến β- thalassemia cho các cặp vợ chồng bị bệnh β-thalassemia khám thai tại Bệnh viện Từ Dũ. Kết quả cho thấy, kỹ thuật ARMS-PCR có chi phí thấp, thời gian chẩn đốn nhanh và độ chính xác 100% [3]. Gần đây nhất, năm 2014, Trần Vân Khánh và cs. khi áp dụng multiplex ARMS-PCR để xác định đồng thời 9 đột biến phổ biến trên gen β-globin ở bệnh nhân β-thalassemia cho kết quả 39/52 trƣờng hợp mang đột biến chiếm tỷ lệ 75% [5].