6. LAI ĐIỂM NGƢỢC (REVERSE DOT BLOT)
6.2 Tối ƣu điều kiện lai điểm ngƣợc
Kỹ thuật lai điểm ngƣợc đƣợc chúng tôi sử dụng nhằm sàng lọc đồng thời ba loại đột biến phổ biến trên gen β-globin ở ngƣời Việt Nam, bao gồm: đột biến tại Cd 17 (A→T), Cd 26 (G→A), Cd 41/42 (-TCTT). Với mỗi đột biến, chúng tơi sử dụng hai loại đầu dị: đầu dị bình thƣờng và đầu dị đột biến. Màng sau khi đƣợc hoạt hóa bằng EDC và chấm các đầu dò sẽ đƣợc lai với trình tự đích đánh dấu biotin (trong nghiên cứu này là đoạn gen β-globin đƣợc khuếch đại nhờ cặp mồi 95 NF/Aso beta R).
Điểm khó khăn của chúng tơi ở đây là phải tối ƣu đƣợc điều kiện lai để sự bắt cặp bổ sung chỉ xảy ra khi hai sợi đơn có trình tự tƣơng đồng 100%, tức là có thể phân biệt sự sai khác chỉ một nucleotide, nhằm phân biệt trình tự đột biến và không đột biến, đồng hợp và dị hợp của cả 3 Cd khảo sát.
Bên cạnh các đầu dị để phát hiện các đột biến, chúng tơi thiết kế các đầu dò P+ và P-. Trong đó, đầu dị P+ có gắn biotin đƣợc chấm lên màng nhằm kiểm tra quá trình gắn SA-AP với biotin và q trình hoạt hóa màng; đầu dị P- đƣợc dùng để kiểm tra tồn bộ q trình lai. Đầu tiên, chúng tơi tiến hành lai màng chứa các đầu dò P+ và P- ở nhiệt độ lai 50oC, đệm lai 6x SSC và đệm rửa 6x SSC. Kết quả lai trên Hình 3.16A cho thấy tín hiệu P+ và P- rõ nét, tƣơng đƣơng nhau, chứng tỏ hiệu quả đánh dấu, quá trình gắn SA-AP với biotin và quá trình lai đều tốt. Với kết quả nhƣ trên, chúng tơi tiến hành q trình lai điểm ngƣợc sử dụng trình tự đích là sản phẩm PCR đánh dấu biotin của mẫu T2 khơng có đột biến. Một µl mỗi loại đầu dị nồng độ 0,5 µM đƣợc chấm lên trên màng. Kết quả lai trên Hình 3.16B cho thấy, chúng tơi đã có thể phân biệt tốt trình tự bình thƣờng và trình tự đột biến của các đầu dò Cd 17 và Cd 41/42. Tuy nhiên, với đầu dò CD26 chúng tơi vẫn thu đƣợc tín hiệu khơng đặc hiệu rõ ở chấm CD26 M. Tín hiệu chấm CD26 M khơng đặc hiệu có thể là
do điều kiện lai chƣa tối ƣu để phân biệt đƣợc trình tự bình thƣờng và trình tự đột biến của đầu dò CD26.
Với mong muốn thu đƣợc kết quả đặc hiệu, chúng tôi tiến hành tăng nhiệt độ lai từ 50 lên 53oC và thay đổi nồng độ muối SSC trong đệm rửa từ 6x xuống 2x. Kết quả lai với trình tự đích là sản phẩm PCR đánh dấu biotin của mẫu T2 khơng có đột biến đƣợc thể hiện trên Hình 3.16C cho thấy: tín hiệu ở chấm CD26 M hầu nhƣ khơng cịn.
Hình 3.16. Kết quả tối ƣu điều kiện lai điểm ngƣợc. Hình A: đầu dị P+, P- ở
điều kiện nhiệt độ lai 50oC, đệm lai 6x SSC, đệm rửa 6x SSC. Hình B: trình tự đích là sản phẩm PCR đánh dấu biotin của mẫu T2 ở điều kiện nhiệt độ lai 50oC, đệm lai 6x SSC, đệm rửa 6x SSC. Hình C: trình tự đích là sản phẩm PCR đánh dấu biotin của mẫu T2 ở điều kiện nhiệt độ lai 53oC, đệm lai 6x SSC, đệm rửa 2x SSC. N: đầu dị bình thƣờng; M: đầu dị đột biến.
Bên cạnh việc tăng nhiệt độ lai lên 60oC trong khi giữ nguyên các điều kiện nhƣ đệm lai 6x SSC, đệm rửa 2x SSC, chúng tôi tiến hành tối ƣu nồng độ đầu dị cả hai loại đầu dị bình thƣờng và đột biến để có thể phát hiện đồng thời trạng thái đồng hợp và dị hợp của 3 đột biến Cd 17, Cd 26 và Cd 41/42.
Đầu tiên, từ kết quả với nồng độ 0,5 µM đã khảo sát ở trên, chúng tôi khảo sát các nồng độ 0,5; 1; 2; 4 µM với đầu dị CD26 N; và các nồng độ 0,1; 0,25; 0,5; 1 µM với đầu dị CD26 M (Hình 3.17A). Sau đó, 1 µl đầu dò đƣợc chấm lên trên màng cùng với các đầu dị P+ và P- nồng độ 1 µM. Kết quả lai
với trình tự đích là sản phẩm PCR đánh dấu biotin mẫu ADN của ngƣời khỏe mạnh bình thƣờng (khơng có 3 đột biến khảo sát) trên Hình 3.17B cho thấy: tại nồng độ 0,25 µM, chúng tơi vẫn thu tín hiệu khơng đặc hiệu khá mờ tại chấm CD26 M; từ nồng độ 0,5 µM, đầu dị CD26 N cho tín hiệu rõ nét. Tiếp đó, kết quả lai với trình tự đích là sản phẩm PCR đánh dấu biotin mẫu T286 có đột biến dị hợp Cd 26 trên Hình 3.17C cho thấy: tại nồng độ 0,25 µM chấm CD26 M cho tín hiệu rõ. Cuối cùng, kết quả lai với trình tự đích là sản phẩm PCR đánh dấu biotin mẫu T365 có đột biến đồng hợp Cd 26 đƣợc thể hiện trên Hình 3.17D cho thấy ở tất cả các nồng độ, chúng tôi đều phân biệt đƣợc đầu dị bình thƣờng và đầu dị đột biến Cd 26.
Hình 3.17. Chuẩn hóa nồng độ đầu dị CD26 chấm lên màng. Hình A: Nồng
khảo sát. Hình C: Mẫu có đột biến dị hợp Cd 26. Hình D: Mẫu có đột biến đồng hợp Cd 26. N: đầu dị bình thƣờng; M: đầu dị đột biến.
Từ các kết quả có đƣợc, chúng tơi tiếp tục khảo sát đầu dò CD26 M trong dải nồng độ từ 0,1-0,25 µM để thu đƣợc tín hiệu đặc hiệu và rõ nét. Với đầu dò CD26 N, chúng tơi chọn nồng độ 3 µM để chấm lên màng. Ở cả 3 màng, tín hiệu đầu dị P+ thu đƣợc đều đậm hơn so với đầu dị P-. Do đó, với đầu dị P+ và P-, chúng tơi chọn các nồng độ 0,5 µM và 1 µM.
Quá trình tối ƣu nồng độ các đầu dị CD17 và CD41/42 đƣợc tiến hành tƣơng tự. Kết quả các nồng độ đầu dị chấm lên màng đƣợc chúng tơi trình bày ở Bảng 3.11. Bảng 3.11. Nồng độ các đầu dò chấm lên màng Đầu dò Nồng độ (µM) P+ 0,5 P- 1 CD17 N 1,3 CD17 M 0,4 CD26 N 3 CD26 M 0,18 CD41/42 N 0,5 CD41/42 M 7,5
Với các nồng độ đầu dò chấm lên màng ở Bảng 3.11, chúng tôi tiến hành lai với trình tự đích là sản phẩm PCR đánh dấu biotin mẫu ADN của ngƣời khơng có 3 đột biến khảo sát. Kết quả lai điểm ngƣợc trên Hình 3.18
cho thấy: chỉ xuất hiện tín hiệu tại đầu dị bình thƣờng nhƣng khơng xuất hiện tín hiệu ở đầu dị đột biến.
Hình 3.18. Kết quả lai điểm ngƣợc trên mẫu ADN của ngƣời khơng có 3 đột
biến khảo sát với các đầu dò CD 17, CD 26, CD 41/42; N: đầu dị bình thƣờng; M: đầu dị đột biến.
Với các điều kiện đã tối ƣu nhƣ trên, chúng tơi tiến hành q trình lai điểm ngƣợc trên các mẫu bệnh phẩm. Để kiểm tra sự sự ổn định của kết quả, q trình lai và thao tác, chúng tơi tiến hành lặp lại thí nghiệm 3 lần trên 3 mẫu: T397 (dị hợp Cd 17), T378 (dị hợp Cd 26), T212 (dị hợp Cd 41/42).
Hình 3.19. Kết quả lai điểm ngƣợc trên ba mẫu bệnh phẩm phát hiện ba đột
biến Cd 17, Cd 26, Cd 41/42 trên gen β-globin; N: đầu dị bình thƣờng; M:
đầu dị đột biến.
Kết quả trên Hình 3.19 cho thấy: xuất hiện chấm 17N và 17M trên mẫu T397; xuất hiện chấm 26N và 26M trên mẫu T378; xuất hiện chấm 41/42N và 41/42M trên mẫu T212. Kết quả lặp lại 3 lần trên 3 mẫu đều cho tín hiệu giống nhau. Nhƣ vậy, với điều kiện đệm lai 6x SSC, đệm rửa 2x SSC, nhiệt độ lai 60oC, kết quả, quá trình lai và thao tác của chúng tơi đạt độ tin cậy.