6. LAI ĐIỂM NGƢỢC (REVERSE DOT BLOT)
6.3 Kết quả lai một số mẫu bệnh phẩm
Với kết quả khả quan nhƣ trên Hình 3.19, chúng tơi tiến hành thử nghiệm kỹ thuật lai điểm ngƣợc trên một số mẫu bệnh phẩm để xác định trạng thái đồng hợp, dị hợp của các đột biến tại Cd 17, Cd 26 và Cd 41/42. Kết quả lai điểm ngƣợc đƣợc trình bày ở Hình 3.20. Tín hiệu P+ và P- đều lên rõ ở tất cả các màng chứng tỏ quả đánh dấu, quá trình gắn SA-AP với biotin và tồn bộ q trình lai đều tốt. Những mẫu có tín hiệu tại chấm 17N và 17M chứng tỏ mẫu đột biến dị hợp Cd 17; những mẫu có tín hiệu tại chấm 17M nhƣng
khơng có tín hiệu tại chấm 17N chứng tỏ mẫu có đột biến đồng hợp Cd 17. Tƣơng tự nhƣ vậy đối với các mẫu có đột biến tại Cd 26 và Cd 41/42.
Hình 3.20. Kết quả lai điểm ngƣợc trên một số mẫu bệnh phẩm phát hiện ba
đột biến Cd 17, Cd 26, Cd 41/42 trên gen β-globin; N: đầu dị bình thƣờng;
M: đầu dị đột biến.
Kết quả lai điểm ngƣợc hồn tồn phù hợp với kết quả phát hiện đột biến bằng kỹ thuật ARMS-PCR (Hình 3.3, 3.4, 3.5 và Phụ lục 1,2,3). Nhƣ
vậy, chúng tôi đã ứng dụng thành công kỹ thuật lai điểm ngƣợc để phát hiện đồng thời ba đột biến Cd 17, Cd 26, Cd 41/42 gây bệnh β-thalassemia tại Việt Nam. Những kết quả chúng tơi có đƣợc cịn rất khiêm tốn so với các nghiên cứu trên thế giới [31,68]. Do đó, trong thời gian tới, chúng tơi mong muốn có thể phát triển kỹ thuật lai điểm ngƣợc để phát hiện các đột biến phổ biến khác gây bệnh β-thalassemia trên ngƣời Việt Nam nhƣ: -28 (A→G), IVS1.1
KẾT LUẬN
Từ các kết quả thu đƣợc, chúng tôi đƣa ra các kết luận sau:
1. Xây dựng và áp dụng đƣợc kĩ thuật ARMS-PCR sàng lọc 288 mẫu thalassemia, phát hiện đƣợc 57 mẫu đột biến Cd 17, 91 mẫu có đột biến Cd 26, 70 mẫu có đột biến Cd 41/42. Trong đó, 3 mẫu đột biến đồng hợp Cd17, 1 mẫu đồng hợp Cd 26, 7 mẫu đồng hợp Cd 41/42. Kỹ thuật này đƣợc áp dụng sàng lọc 152 mẫu máu ngƣời khỏe mạnh phát hiện đƣợc 3 mẫu có đột biến Cd 17, 9 mẫu có đột biến Cd 26, 3 mẫu có đột biến Cd 41/42, 1 mẫu có đột biến Cd 95.
2. Tối ƣu hóa đƣợc q trình lai điểm ngƣợc phát hiện và phân biệt trạng thái đồng hợp-dị hợp đồng thời ba đột biến Cd 17, Cd 26 và Cd 41/42 trên gen β-
globin. Kết quả lai điểm ngƣợc hoàn toàn phù hợp với kết quả phát hiện đột
biến bằng kỹ thuật ARMS-PCR.
KIẾN NGHỊ
Để phát triển đề tài, chúng tôi đƣa ra kiến nghị sau:
- Phát triển kỹ thuật lai điểm ngƣợc để phát hiện một số đột biến phổ biến khác trên ngƣời Việt Nam nhƣ -28 (A→G), IVS 1.1 (G→T), IVS 2.654 (C→T), Cd 95 (+A).
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Lý Thị Thanh Hà, Nguyễn Thị Phƣơng Mai, Nguyễn Thị Mai Hƣơng, Ngô Diễm Ngọc, Dƣơng Bá Trực, Nguyễn Thanh Liêm, Nguyễn Thị Tân Sinh (2012), "Áp dụng kỹ thuật ARMS-PCR trong chẩn đoán trƣớc và sau sinh bệnh beta thalassemia tại bệnh nhi trung ƣơng", Tạp chí nghiên cứu Y học, 1, tr.36-40.
2. Nguyễn Khắc Hân Hoan (2013), “Nghiên cứu tầm soát và chẩn đoán trƣớc sinh bệnh alpha và beta thalassemia”, Luận án tiến sĩ y học, Đại học Y dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh.
3. Nguyễn Khắc Hân Hoan, Quách Thị Hoàng Oanh, Phạm Việt Thanh, Trƣơng Đình Kiệt (2008), “Chẩn đốn di truyền phân tử bệnh beta thalassemia tại Bệnh viện Từ Dũ”, Y học Thành phố Hồ Chí Minh,
12, tr.341-347.
4. Nguyễn Thị Thu Hƣờng (2013), Thiết kế đầu dò ADN cho kỹ thuật lai Dot
Blot, Luận văn thạc sĩ Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên.
5. Trần Vân Khánh, Phạm Thanh Loan, Hồ Cẩm Tú, Trần Thị Oanh, Nguyễn Đức Hinh, Trần Huy Thịnh, Tạ Thành Văn (2014), “Phát hiện đột biến gen gây bệnh beta thalassemia bằng kỹ thuật multiplex ARMS- PCR”, Tạp chí Nghiên cứu Y học, 90 (5), tr. 17-25.
6. Trần Thị Thuý Minh (2015), Tỷ lệ mắc và kiểu hình gen bệnh alpha và beta
thalassemia ở trẻ em dân tộc Ê đê và M’nông tỉnh Đắk Lắk, Luận án
7. Bùi Văn Viên (1999), Một số đặc điểm lâm sàng, huyết học bệnh Hemoglobin E và tần suất người mang gen hemoglobin E ở dân tộc Mường Hịa Bình, Luận văn tiến sĩ y học, Đại học Y Hà Nội.
Tiếng Anh
8. Borgna-Pignatti C., Cappellini M. D., De Stefano P., Del Vecchio G. C., Forni G. L., Gamberini M. R., Ghilardi R., Origa R., Piga A., Romeo M. A., Zhao H., Cnaan A. (2005), "Survival and complications in thalassemia", Annals of the New York Academy of Sciences, 1054,
pp. 40-47.
9. Bulger M., Bender M. A., van Doorninck J. H., Wertman B., Farrell C. M., Felsenfeld G., Groudine M., Hardison R. (2000), "Comparative structural and functional analysis of the olfactory receptor genes flanking the human and mouse β-globin gene clusters", Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 97, pp. 14560-14565.
10. Camaschella C., Kattamis A. C., Petroni D., Roetto A., Sivera P., Sbaiz L., Cohen A., Ohene-Frempong K., Trifillis P., Surrey S., Fortina P. (1997), "Different hematological phenotypes caused by the interaction of triplicated alpha-globin genes and heterozygous beta-
thalassemia", American Journal of Hematology, 55, pp. 83–88. 11. Cappellini M., Cohen A., Eleftheriou A., Piga A., Porter J., and Taher A.
(2008), “Guidelines for the clinical management of thalassemia”, 2nd revised edition, Thalassemia international federation.
12. Cao A., Rosatelli C., Pirastu M., Galanello R. (1991), “Thalassemias in Sardinia: molecular pathology, phenotype-genotypecorrelation and prevention”, The
13. Cao A., Galanello R. (2010), "Beta-thalassemia", Genetics in Medicine, 12, pp. 61-76.
14. Colah R., Gorakshakar A., Nadkarni A. (2010), "Global burden, distribution and prevention of β-thalassemias and hemoglobin E disorders", Expert Review of Hematology, 3, pp. 103–117.
15. Chang J. C., Alberti A., Kan Y. W. (1983), "A beta-thalassemia lesion abolishes the same Mst II site as 52.the sickle mutation", Nucleic Acids Research, 11, pp. 7789-7794.
16. Cheng T., Stuart H., Antonarakis O. S., Potter M. J., Sextont J. P., Markhamt A. F., Giardina P. J. V., Li A., Kazazian H. H. (1984), "β- thalassemia in Chinese: Use of in vivo RNA analysis and oligonucleotide hybridization in systematic characterization of molecular defects", Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States, 81, pp. 2821-2825.
17. Dianandis E. P., Christopoulos T. K. (1991), "The biotin-(strept)avidin system: Principles and applications in biotechnology", Clinical chemistry, 37, pp. 625-636.
18. Efstratiadis A., Posakony J. W., Maniatis T., Lawn R. M., O‟Connell C., Spritz R. A., DeRiel J. K., Forget B. G., Weissman S. M., Sligh-tom J. L., Blechl A. E., Smithies O., Baralle F. E., Shoulders C. C., Proudfoot N. J. (1980), "The structure and evolution of the human
beta-globin gene family", Cell, 21, pp. 653-668.
19. Eleftheriou A., Traeger-Synodinos J., Old J., Petrou M., Angastiniotis M. (2003), "Screening and diagnosis for hemoglobin disorders. In: Prevention of thalassemia and other hemoglobin disorders",
20. Fan Y. C., Lian K. T., Ching Y. W., Chui Y. W., Fan S. Y., Anne M. A. J. T. (2001), "The use of the Amplification Refractory Mutation System (ARMS) in the detection of rare β-thalassemia mutations in the Malays and Chinese in Malaysia", Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health, 32, pp. 872-879.
21. Filon D., Oppenheim A., Rachmilewitz E. A., Kot R., Truc D. B. (2000), "Molecular analysis of β-Thalassemia in Vietnam", Hemoglobin,
24(2), pp. 99-104.
22. Fucharoen G., Sanchaisuriya K., Sae-Ung N., Dangwibul S., Fucharoen S. (2004), "A simplified screening strategy for thalassemia and HbE in rural communities in South-East Asia", Bulletin World Health Organization, 82, pp. 364–372.
23. Galanello R., Origa R. (2010), "Beta-thalassemia", Orphanet journal of rare dieases, 5(11), pp. 1-15.
24. Galanello R., Ruggeri R., Paglietti E., Addis M., Melis M. A., Cao A. (1983), "A family with segregating triplicated alpha globin loci and β-thalassaemia", Blood, 62(1035), pp. 1035-1040.
25. Ghosh K., Colah R., Manglani M., Prakash V., Verma C., Madan N., Saxena R., Jain D., Marwaha N., Mohanty D., Das R., Choudhary R., Agarwal S., Ghosh M., Ross C., Mohanty D. (2014), "Guidelines for screening, diagnosis and management of hemoglobinopathies",
Indian Journal of Human Genetics, 20, pp. 101-119.
26. Grow K. I, Vashist M., Abrol P., Sharma S., Yadav R. (2014), “Beta thalassemia in India: Current status and the challenges ahead”,
International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 4, pp. 28-33.
27. Keing M. M., Ogden L. L., Wrightstone, Wilson J. B. , Reynolds C. A., Kitchens J. L., Huisman T. H. J. (1971), “Hemoglobin Louisville (p42 (CD1) Phe-Leu): an Unstable Variant Causing Mild Hemolytic Anemia”, The Journal of Clinical Investigation, 50, pp. 2395-2402. 28. Keller G. H., Manak M. M. (1989), “DNA probes”, Stockton, New York. 29. Khan H., Shaikh J., Kumbhakarna N. (2016), “Study of haematological
profile of thalassemia patients with reference to high performance liquid chromatography”, Journal of Medical Science And Clinical Research, 4, pp. 14270 -14276.
30. Kohne E. (2011), “Hemoglobinopathies: Clinical manifestations, diagnosis, and treatment”, Deutsches Ärzteblatt International,
108(31-32), pp. 532-540.
31. Li D., Liao C., Li J., Huang Y., Xie X., Wei J., Wu S. (2006), "Prenatal diagnosis of beta-thalassemia by reverse dot-blot hybridization in southern China", Hemoglobin, 30, pp. 365-370.
32. Li D., Liao C., Li J., Xie X., Huang Y., Zhong H. (2006), “Detection of α- thalassemia in β-thalassemia carriers and prevention of Hb Bart‟s hydrops fetalis through prenatal screening”, Haematologica/the hematology journal, 91(5), pp. 649-651.
33. Lim W. F., Muniandi L., George E., Sathar J., Teh L. K., Lai M. I. (2015), “HbF in HbE/β-thalassemia: A clinical and laboratory correlation”, Hematology, 20(6), pp. 349-53.
34. Lin M., Zhu J. J., Wang Q., Xie L. X., Lu M., Wang J. L., Wang C. F., Zhong T. Y., Zheng L., Pan M. C., Wu J. R., Wen Y. F., Liu G. R., Zhan X. F., Lin F., Yang L. Y. (2012), "Development and evaluation of a reverse dot blot assay for the simultaneous detection of common
alpha and beta thalassemia in Chinese", Blood Cells, Molecules and Disese, 48, pp. 86-90.
35. Little S. (1995), "Molecular Diagnostics", Current Protocols in Human Genetics Clinical, 9.8.1-9.8.12.
36. Moiz B., Hashmi M. R., Nasir A., Rashid A., Moatter T. (2012), “Hemoglobin E syndromes in Pakistani population”, BMC Blood Disorders, 12, pp. 1-6.
37. Mondal S. K., Mandal S. (2016), “Prevalence of thalassemia and hemoglobinopathy in eastern India: A 10-year high-performance liquid chromatography study of 119,336 cases”, Asian Journal of Transfusion Science, 10, pp. 105-110.
38. Med Lett Drugs Ther (2006), "Deferasirox (Exjade): a new iron chelator", 48, pp. 35-36.
39. Metherall J. E., Collins F. S., Pan J., Weissman S. M., Bernard B. G. (1986), "βo- Thalassemia caused by a base substitution that creates an alternative splice acceptor site in an intron", The EMBO Journal, 5,
pp. 2551 -2557.
40. Najmabadi H., Teimourian S., Khatibi T., Neishabury M., Farziourfarzad, Jalil-Nejad S., Azad M.,Oberkanins C., Krugluger W. (2001), "Amplification Refractory Mutation System (ARMS) and reverse hybridization in the detection of beta-thalassemia mutations",
Archive of Iranian Medicine, 4, pp. 165-170.
41. Newton C. R., Graham A., Heptinstall L. E. (1989), "Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS)". Nucleic Acids Research, 17, pp. 2503-2516.
42. Old J. M., "Hemoglobinopathies. Community clues to mutation detection" (1996), Methods in Molecular Medicine: Molecular Diagnosis of Genetic Diseases, pp. 169-183.
43. Orkin H. S. , Kazazian H. H., Antonarakis E. S. , Ostrer H. , Goff C. S. , Sexton P. J. (1982), "Abnormal RNA processing due to the exon mutation of beta E globin gene", Nature, 300, pp. 23-30.
44. Orkin S. H., Antonarakis S. A., Loukopoulos D. (1984), "Abnormal processing of beta Knossos RNA", Blood, 64, pp. 311-313.
45. Passarge E. (2001), "Color alats of genetics", Thieme Stuttgart, New
York.
46. Patel J., Patel A., Patel J., Kaur A., Patel V. (2008), “Prevalence of haemoglobinopathies in Gujarat, India: A cross-sectional study”, The
Internet Journal of Hematology, pp. 1-6.
47. Premawardhena A., Fisher C. A., Olivieri N. F., de Silva S., Arambepola M., Perera W., O‟Donnell A., Peto T. E. A., Viprakasit V., Merson L., Muraca G., Weatherall D. J. (2005), “Haemoglobin E thalassaemia in Sri Lanka”, Lancet, 366, pp. 1467–7140.
48. Ristaldi M. S., Pirastu M., Rosatelli C., Cao A. (1989), "Prenatal diagnosis of β-thalassaemia in Mediterranean populations by dot blot analysis with DNA amplification and allele specific oligonucleotide probes", Prenatal diagnosis, 9, pp. 629-638.
49. Roberts D. J., Brunskill J., Doree C., Williams S., Howard J., Hyde C. J. (2007), "Oral deferiprone for iron chelation in people with thalassaemia", The Cochrane Database of Systematic Reviews, UK.
50. Rund D., Rachmilewitz E. (2000), “New trends in the treatment of beta thalassemia”, Critical Rewiews in Oncology:Hematology, 33, pp.
105-118.
51. Rust S., H. Funke, G. Assmann (1993), “Mutagenically separated PCR (MS-PCR): a highly specific one step procedure for easy mutation detection”, Nucleic Acids Research, 21(16), pp. 3623-3629.
52. Sambrook J., Russell D. W. (2001), “Molecular cloning:a laboratory manual”, 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
53. Saiki R. K., Walsh P.S., Levenson C. H., Erlich H. A. (1989), "Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes", Proceedings of the National Academy of Sciences of America, 86, pp. 6230-6234.
54. Spritz R. A., Jagadeeswaran P., Choudary P. V., Andrew biro P., Elder J. T., Deriel J. K., Manley J. I., Geftrer M. I., Forget B. G., Weissman S. M. (1981), "Base substitution in an intervening sequence of a f3'- thalassemic human globin gene", Proceedings of the National Academy of Sciences of America, 78, pp. 2455-2459.
55. Strachan T., Read A. P. (2004), “Human Molecular Genetics”, 3rd edition, Garland Science.
56. Sutcharitchan P., Saiki R., Huisrnan T. H. J., Kutlar A., McKie V., Erlich H., Ernbury S. H. (1995), "Reverse dot blot detection of the African- American β-Thalassemia mutations", Blood, 4, pp. 1580-1585.
57. Svasti S., Hieu T. M., Munkongdee T., Winichagoon P., Be T. V., Binh T. V., Fucharoen S. (2002), "Molecular analysis of beta-thalassemia
in South Vietnam", American Journal of Hematology journal, 71(2), pp. 85-88.
58. Tamagnini G. P., Lopes M. C., Castanheira M. E., Wainscoat J. S., Wood W. G. (1983), "β+Thalassaemia: Portuguese type clinical, haematological and molecular studies of a newly defined form of β- thalassaemia", British Journal of Haematology, 54, pp. 189-200. 59. Tan J. A. M. A., Tay J. S. H., Lin L. I., Kham S. K. Y., Chia I. N. (1994),
"The Amplification Refractory Mutation System (ARMS) a rapid and direct prenatal diagnostic technique for β-thalassaemia in Singapore", Prenatal Diagnosis, 14, pp. 1077-1082.
60. Thedsawad A., Jindadamrongwech S., Suporn Chuncharuneeand S., Punnee B. (2012), “Multiplex ARMS-PCR Analysis for Nineteen β- Thalassemiamutations”, Journal of Hematology and Transfusion Medicine, 22, pp. 31-40.
61. Thein S. L. (2005), "Genetic modifiers of beta thalassemia",
Haematologica/ The Tematology Journal, 90(5), pp. 649-660.
62. Traeger-Synodinos J., Kanavakis E., Vrettou C., Maragoudaki E., Michael T., Metaxotou-Mavromati A. (1996), "The triplicated alpha-globin gene locus in beta-thalassaemia heterozygotes: clinical,haematological, biosynthetic and molecular studies", British Journal of Haematology, 95, pp. 467-471.
63. Uddin M. M., Akteruzzaman S., Rahman T., Hasan K. M., Shekhar H. U. (2012), “Pattern of β-Thalassemia and other haemoglobinopathies: A cross-sectional study in Bangladesh”, Hematology, pp. 349-353. 64. Usman M., Moinuddin M., Ghani R., Usman S. (2009), “Screening of
population”, Sultan Qaboos University Medical Journal, 9, pp. 305-
310.
65. Walker J. M. , Rapley R. (2008), “Molecular Biomethods Handbook”, 2nd edition, Humana Press.
66. Watson J. D., Crick F. H. C. (1953), “Genetical implications of the structure of deoxyribonucleic acid”, Nature, 171, pp. 964-967.
67. Way J. S., Eng B. (2005), "Allele-specific mutation detection by PCR- ARMS and PCR-ASO", Molecular Diagnosis, 2005, pp. 15-22. 68. Winichagoon P., Saechan V., Sripanich R., Nopparatana C.,
Kanokpongsakdi S., Maggio A., Fucharoen S. (1999), “Prenatal Diagnosis of β-thalassaemia by reverse dot-blot hybridization”,
Prenatal Diagnosis, 19, pp. 428–435.
69. Weatherall D. J., Akinyanju O., Fucharoen S., Olivieri N., Musgrove P. (2006), "Inheried Disorders of Hemoglobin", Oxford University Press and the World Bank, pp. 663–680.
70. Weatherall D. J., Clegg J. B., Gibbons R., Higgs D. R., Old J. M., Olivieri N. F., Thein S. L., Wood W. G. (2001), “The Thalassaemia Syndromes”, 4 edition.
71. Wolcot M. J. (1992), “Advances in nucleic acid-based detection methods”, Clinical microbiology reviews, vol 5, pp. 370-386.
72. Wongprachum K., Sanchaisuriya K., Dethvongphanh M., Norcharoen B., Htalongsengchan B., Vidamaly V., Sanchaisuriya P., Fucharoen S., Fucharoen G., Schelp F. P. (2016), “Molecular heterogeneity of thalassemia among pregnant Laotian women”, Acta Haematologica,
73. World Health Organization (2007), “Management of haemoglobin disorders”, Report of a joint WHO-TIF meeting, Cyprus.
74. Yang K. G., Kutlar F., George E., Wilson J. B., Kutlar A., Stoming T. A.,