2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.7 Phƣơng pháp tách dòng
Đoạn gen đích chứa đột biến đƣợc khuếch đại bằng cặp mồi 95 NF và Control R với điều kiện và thành phần phản ứng nhƣ Bảng 2.10.
Bảng 2.10. Thành phần và điều kiện phản ứng khuếch đại đoạn gen đích cần
tách dịng
Thành phần Thể tích (µl)
H2O 4,9
GoTaq Master Mix 2x 7,5
95 NF 10 µM 0,3 Control R 10 µM 0,3 ADN (15-20 ng) 2,0 Tổng 15,0 94oC 2’; [94oC 30s; 68oC 20s; 72oC 15s]x35 chu kì; 72oC 5’; 20oC ∞ 2.2.7.2 Phản ứng nối
Sản phẩm PCR đƣợc đƣa vào vector pTZ57R/T tạo plasmid tái tổ hợp theo quy trình của InsTAclone PCR Cloning Kit (Thermo) theo đúng hƣớng dẫn của nhà sản xuất.
2.2.7.3 Biến nạp bằng sốc nhiệt
Các sản phẩm của phản ứng nối đƣợc biến nạp vào tế bào theo phƣơng pháp sốc nhiệt gồm các bƣớc cơ bản nhƣ sau:
- Lấy tế bào khả biến E. coli JM109 từ -80oC, để trên đá 5-10 phút - Bổ sung 5 μl hỗn hợp của phản ứng nối, búng nhẹ, ủ trên đá 10 phút - Sốc nhiệt hỗn hợp ở 42oC trong 45 giây, để lại trên đá 90 giây
- Bổ sung 1 ml môi trƣờng LB, ủ 37oC trong 30 phút, lắc 200 vòng/phút ở 37oC trong 1 giờ
- Ly tâm hỗn hợp ở nhiệt độ phòng, 13000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ 900 μl dịch phía trên
- Hồ tan phần tủa bằng 100 μl dung dịch còn lại và trải trên đĩa thạch LB có bổ sung ampicillin (50 μg/ml).
2.2.7.4 Sàng lọc khuẩn lạc và ni tế bào bão hịa
Khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp đƣợc sàng lọc trực tiếp bằng phƣơng pháp PCR sử dụng cặp mồi M13 F/R của vetor pTZ57R/T. Sau đó các khuẩn lạc tiếp tục đƣợc sàng lọc với cặp mồi đặc hiệu của đoạn chèn. Phản ứng PCR với mồi vector M13 F/R đƣợc tiến hành với các thành phần và điều kiện nhƣ trong Bảng 2.11.
Bảng 2.11. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR với cặp mồi M13 F/R Thành phần Thể tích (µl)
H2O 10,0
Đệm Taq DNA polymerase 1,5
dNTPs (2 mM mỗi loại) 0,5
M13 F 10 μM 0,25
M13 R 10 μM 0,25
Taq DNA polymerase 0,5
ADN 2,0
Tổng 15,0
94oC 5’; [94oC 30s; 62oC 30s; 72oC 20s]x40 chu kì; 72oC 5’; 20oC ∞
2.2.7.5 Phƣơng pháp tách plasmid
Plasmid đƣợc tách theo quy trình của Sambrook và Russell [52]. Các bƣớc tiến hành nhƣ sau:
- Cho 1,5 ml môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn chứa plasmid vào ống eppendorf, ly tâm 13000 vòng/phút ở 4oC trong 5 phút, loại bỏ dịch nổi, để cặn tế bào khô
- Hoà cặn trong 100 µl dung dịch I (50 mM Tris-HCl pH 8; 5 mM glucose; 10 mM EDTA pH 8) bằng máy vortex, ủ trên đá 5 phút
- Thêm 200 µl dung dịch II (0,2 N NaOH; 1% SDS), ủ ở nhiệt độ phòng 3 phút
- Thêm 150 µl dung dịch III (3 M C2H3O2K pH 5,2), đảo nhẹ, ủ trên đá 5 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút ở 4oC, 15 phút, thu dịch nổi phía trên
- Bổ sung 1 thể tích Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1), trộn đều bằng máy vortex. Ly tâm 13000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, thu dịch pha trên
- Thêm 0,6 thể tích Isopropanol, đảo 3-5 lần, ủ ở nhiệt độ phòng 5-10 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút ở 4oC trong 15 phút
- Bổ sung 1 ml cồn 70% để rửa tủa. Ly tâm 13000 vòng/phút ở 4oC trong 5 phút, bỏ dịch nổi và để khơ tủa. Hồ tủa trong 30 µl H2O bổ sung RNase (20 µg/ml), ủ ở 37oC trong 30 phút. Plasmid đƣợc bảo quản ở 4oC.