5. BIẾN NẠP, TÁCH DÒNG VÀ GIẢI TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN β-
5.1 Biến nạp, tách dòng
Chúng tôi lựa chọn các mẫu T57 có đột biến đồng hợp Cd 17, mẫu T365 có đột biến đồng hợp Cd 26, mẫu T85 có đột biến đồng hợp Cd 41/42 và mẫu T99 khơng có đột biến để tách dịng, xác định trình tự đoạn gen đoạn gen β-globin có đột biến Cd 17, Cd 26, Cd 41/42 và trình tự khơng có đột
biến.
Đầu tiên, chúng tôi sử dụng ADN tổng số làm khuôn cho phản ứng PCR khuếch đại trình tự 700 bp của gen β-globin bằng cặp mồi 95
NF/Control R. Thành phần và điều kiện phản ứng đƣợc trình bày trong Bảng 2.10.
Kết quả điện di sản phẩm PCR đƣợc trình bày ở Hình 3.6. Sản phẩm PCR đƣợc sử dụng trực tiếp để đƣa vào vector pTZ57R/T và biến nạp vào tế bào khả biến E. coli JM109 theo phƣơng pháp trình bày ở Mục 2.2.7.2 và
2.2.7.3.
Khuẩn lạc đƣợc sàng lọc trên mơi trƣờng có bổ sung ampicilin nồng độ 50 μg/ml. Các khuẩn lạc này tiếp tục đƣợc sử dụng trực tiếp trong phản ứng PCR sử dụng cặp mồi M13 F/R của vetor pTZ57R/T để xác định chính xác sự có mặt của đoạn chèn trong plasmid tái tổ hợp. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR đƣợc trình bày trong Bảng 2.11.
Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen β-globin bằng
cặp mồi 95 NF/Control R. Giếng T57-T365: các mẫu bệnh phẩm; Giếng (-): đối chứng âm (khơng có ADN khn); M: thang chuẩn ADN 100 bp.
Kết quả sàng lọc với cặp mồi M13 F/R đƣợc thể hiện trên Hình 3.7 cho thấy, tất cả các khuẩn lạc đều lên băng kích thƣớc là 855 bp nhƣ tính tốn. Từ kết quả sàng lọc khuẩn lạc với cặp mồi vector nhƣ trên, chúng tôi tiến hành nuôi khuẩn lạc để tách các plasmid và xác định trình tự đoạn gen β-globin
chứa đột biến Cd 17, Cd 26, Cd 41/42 và khơng có đột biến.
Hình 3.7. Kết quả PCR kiểm tra các khuẩn lạc với cặp mồi vector M13 F/R.
Hình A: khuẩn lạc 1.1-1.5 của mẫu T57 có đột biến đồng hợp Cd 17. Hình B: khuẩn lạc 2.1-2.7 của mẫu T85 có đột biến đồng hợp Cd 41/42. Hình C: khuẩn lạc 3.1-3.5 của mẫu T99 khơng có đột biến. Hình D: khuẩn lạc 4.1-4.4
của mẫu T365 có đột biến đồng hợp Cd 26. Giếng (-): đối chứng âm (khơng có khn ADN); M: marker 100 bp.
Chúng tôi chọn các khuẩn lạc số 1.1, 2.1, 3.1, 4.1 để ni bão hịa qua đêm và tiến hành tách plasmid. Plasmid tách chiết đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1% (Hình 3.8).
Hình 3.8. Kết quả tách plasmid. Giếng 1.1-4.1: plasmid tách từ các khuẩn lạc
1.1-4.1; M: thang chuẩn ADN SY 4,6 kb.
Các plasmid sau khi tách đƣợc chúng tôi tiếp tục kiểm tra với các cặp mồi xác định đột biến. Kết quả điện di sản phẩm PCR đƣợc trình bày trên Hình 3.9 cho thấy các plasmid 1.1, 2.1, 4.1 đều lên băng với mồi đột biến tƣơng ứng.
Hình 3.9. Kết quả PCR kiểm tra plasmid 1.1, 2.1, 4.1 lần lƣợt với mồi đột biến Cd 17, Cd 41/42, Cd 26. Giếng (-): đối chứng âm (khơng có ADN khn); (+): đối chứng dƣơng (các mẫu có đột biến đã đƣợc kiểm tra bằng kỹ thuật ARMS-PCR); M: marker 100 bp.
Với các kết quả trên, chúng tôi lựa chọn các plasmid 1.1, 2.1, 3.1, 4.1 để xác định trình tự.