2.1.1 Nguyên liệu
- Hai trăm tám mƣơi tám (288) mẫu bệnh phẩm thalassemia đƣợc cung cấp bởi Viện Huyết học – Truyền máu Trung ƣơng (2012)
- Một trăm năm mƣơi hai (152) mẫu máu ngƣời bình thƣờng kiểm tra sức khỏe tại bệnh viện Bạch Mai (2015).
2.1.2 Hóa chất
- GoTaq Master Mix 2x (Promega)
- Đệm Taq DNA polymerase (có chứa Mg2+ 20 mM) - DreamTaq (Fermentas)
- Đệm DreamTaq polymerase 10x (có chứa Mg2+ 20 mM) (Fermentas) - Biotin-11-dUTP (Fermentas)
- Streptavidin Alkaline Phosphatase (Promega) - Tween 20 (Sigma)
- Chất hoạt hóa màng nylon Biodyne C: EDC (1-Ethyl-3-[3- dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride) (Sigma-Aldrich)
- Cơ chất cho phản ứng tạo màu: Western Blue Stabilized Substrate for Alkaline Phosphatase (Promega)
- Agarose (Takara)
- Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn Lysogeny Broth (LB) gồm 1% trypton; 0,5% cao nấm men; 0,5% NaCl
- Marker 100 bp (Fermentas)
- Chủng tế bào khả biến E. coli JM109 đƣợc cung cấp bởi Phịng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội
- Kit tách ADN tổng số từ mẫu máu: Thermo Scientific™ GeneJET™ Whole Blood Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo)
- Kit nhân dòng gen: InsTAclone PCR Cloning Kit (Thermo)
- Các dung dịch d̀ùng trong quá trình lai đi ểm ngƣợc đƣợc trình bày trong Bảng 2.1
- Các hóa chất thơng dụng khác đều đạt độ sạch dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử.
Bảng 2.1. Thành phần các dung dịch dùng trong quá trình lai điểm ngƣợc
Dung dịch Thành phần H SSC 6x; Denhardt 5x; SDS 0,1% W SSC 2x; SDS 0,1% U1 Tris-HCl 0,1 M pH 7,5; NaCl 0,15 M U2 Tris-HCl 0,1 M pH 9,5; NaCl 0,1 M; MgCl2 0,05 M
SSC 1x NaCl 0,015 M; Natri citrat (Na3C6H5O7) 0,15 M pH 7
Denhardt 1x Ficoll 400 0,02%; Polyvinylpyrrolidone 0,02%; Bovine serum albumin 0,02%
2.1.3 Trình tự các đầu dị oligo sử dụng trong nghiên cứu
Các đầu dò oligo dùng trong kỹ thuật lai điểm ngƣợc đƣợc gắn thêm nhóm amin ở đầu 5', giúp liên kết với nhóm carboxyl trên màng nylon Biodyne C. Toàn bộ các đầu dò dùng trong nghiên cứu đƣợc cung cấp bởi hãng IDT (Mỹ). Trình tự các oligo đƣợc trình bày trong Bảng 2.2.
Bảng 2.2. Trình tự các đầu dị oligo dùng trong kỹ thuật lai điểm ngƣợc
(nucleotide gạch chân tƣơng ứng với đột biến)
Tên đầu dị oligo Trình tự (5' - 3') CD17 N NH2-C6-GTGGGGCAAGGTGAACG CD17 M (A→T) NH2-C6-TGGGGCTAGGTGAACG CD26 N NH2-C6-TTGGTGGTGAGGCCCT CD26 M (G→A) NH2-C6-TTGGTGGTAAGGCCCTG CD41 N NH2-C6-CAGAGGTTCTTTGAG CD41 M (- TCTT) NH2-C6-CAGAGGTTGAGTCCT P+ NH2-C12-GTCTTCTCTGTCTCC P- NH2-C12-
2.1.4 Trình tự các mồi
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng các cặp mồi nhằm sàng lọc đồng thời bốn loại đột biến trên gen β-globin (NC_000011.8) phổ biến ở
ngƣời Việt Nam: Cd 17 (A→T), Cd 26 (G→A), Cd 41/42 (-TCTT) và Cd 95 (+A). Trong đó, cặp mồi nội kiểm 95 NF/Control R đƣợc thiết kế dựa trên trình tự gen β-globin nhằm khuếch đại vùng chứa các đột biến đƣợc nghiên
cứu. Các mồi 17 MR, 26 MR, 41/42 MR, 95 MR đƣợc thiết kế dựa trên trình tự đột biến để phát hiện các đột biến tại Cd 17, Cd 26, Cd 41/42 và Cd 95 trên gen β-globin đã đƣợc sử dụng trong một số nghiên cứu của Phịng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên [4]. Các mồi 17 NF, 26 NF, 41/42 NF đƣợc thiết kế dựa trên trình tự gen β-globin nhằm xác
định kiểu gen đồng hợp hoặc dị hợp. Toàn bộ mồi dùng trong nghiên cứu đƣợc cung cấp bởi hãng IDT (Mỹ). Sơ đồ minh họa vị trí các mồi đƣợc trình bày ở Hình 2.1.
Hình 2.1. Sơ đồ minh họa vị trí các mồi sử dụng trong nghiên cứu.
Trình tự các mồi đƣợc trình bày trong Bảng 2.3. Toàn bộ mồi dùng trong nghiên cứu đƣợc cung cấp bởi hãng IDT (Mỹ).
Bảng 2.3. Trình tự các mồi sử dụng trong nghiên cứu
Tên mồi Trình tự (5’-3’) Mục đích
95 NF CCAATCTACTCCCAGGAGCAG
GG
Mồi nội kiểm Control R CGATCCTGAGCTCCACACTGAT
G
17 MR ACTTCATCCACGTTCACCTA Phát hiện đột biến Cd 17
26 MR CCAACCTGCCCAGGGCCTT Phát hiện đột biến Cd 26 41/42 MR GGACAGATCCCCAAAGGACTC A Phát hiện đột biến Cd 41/42 95 MR TTCAGGATCCACGTGCAGCTTT G Phát hiện đột biến Cd 95 17 NF CCGTTACTGACCTGTGGGGCA Phát hiện đồng hợp/dị hợp Cd 17 26 NF GTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTG Phát hiện đồng hợp/dị hợp Cd 26 41/42 NF TCTACCCTTGGACCCAGAGGTTC Phát hiện đồng hợp/dị hợp Cd 41/42 Probe F2 GGCTCATGGCAAGAAAGTGCT Đánh dấu biotin đoạn
gen
β-globin
Aso beta R
GTTGCCCATAACAGCATCAGG
M13 F GTAAAACGACGGCCAGT Phát hiện đoạn ADN
chèn trong vector
M13 R GTAAAACGACGGCCAGT
2.1.5 Thiết bị
Các máy móc, thiết bị phục vụ cho nghiên cứu thuộc Phịng thí nghiệm Sinh Y - Khoa Sinh học; Phòng Sinh học Phân tử - Trung tâm nghiên cứu Khoa học sự sống Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.