2.2.2. Phương pháp xác định tính chất của nano astaxanthin
2.2.2.1 Đánh giá hình thái và kích thước các mẫu vật liệu nano bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission electron microscopy - TEM) kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission electron microscopy - TEM)
Mẫu đo TEM được chuẩn bị bằng cách nhỏ dung dịch nano (hạt nano phân tán trong toluene) với nồng độ rất thấp lên một lưới đồng phủ carbon và sau đó để dung mơi bay hơi tự nhiên. Hình thái của các hạt nano astaxanthin được xác định bằng kính hiển vi điện tử truyền qua JEM 1400 tại phịng thí nghiệm trọng điểm Quốc gia vật liệu polyme và compozit –Trường Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.
2.2.2.2 Nghiên cứu sự phân bố kích thước hạt của nano astaxanthin bằng phương pháp tán xạ ánh sáng động (Dynamic Light Scattering – DLS) bằng phương pháp tán xạ ánh sáng động (Dynamic Light Scattering – DLS)
Mẫu nano astaxanthin được phân tán trong nước ở nồng độ thích hợp. Sự phân bố kích thước hạt của các mẫu nano được xách định bằng thiết bị tán xạ ánh sáng động DLS Litesizer™ 500 tại Viện Hố học, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam.
2.2.3. Phương pháp đánh giá một số hoạt tính sinh học của nano astaxanthin ở mức độ in vitro. astaxanthin ở mức độ in vitro.
2.2.3.1. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa bằng DPPH
Hoạt tính chống oxi hóa của astaxanthin và nano astaxanthin được tiến hành theo phương pháp của Abramovič và cộng sự [76] có cải tiến cho phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm. Cụ thể: dung dịch gốc astaxanthin được hịa tan trong dung mơi methanol và nano astaxanthin được hòa tan trong nước cất khử ion, sau đó các dung dịch gốc này được pha thành các dải nồng độ thử nghiệm với nước cất khử ion. DPPH được pha trong methanol (100%) đến nồng độ 0,25 µM. Hút mẫu nghiên cứu đã pha ở các nồng độ vào đĩa 96. Thêm dung dịch DPPH đã chuẩn bị ở trên vào các giếng đã có sẵn mẫu nghiên cứu (tỉ lệ 1:1). Đối chứng là mẫu thử chỉ có 100 µl nước cất khử ion và 100 µl DPPH. Ủ ở nhiệt độ phịng trong 30 phút. Xác định độ hấp thụ của dung dịch sau phản ứng tại bước sóng 517 nm.
Phần trăm ức chế các gốc tự do của mẫu thử được tính theo cơng thức: % Ức chế = [(ODđối chứng – ODmẫu thử) /ODđối chứng] *100
Trong đó: ODđối chứng: Độ hấp thụ tại giếng không chứa chất thử ODmẫu thử: Độ hấp thụ tại giếng chứa chất thử
2.2.3.2. Phương pháp nuôi cấy tế bào
Tế bào HepG2 được ni cấy trên mơi trường DMEM/high glucose có chứa 10% FBS, 100 U/mL penicillin, và 0,1 mg/mL streptomycin trong tủ nuôi cấy vô trùng ở 37°C, 5% CO2. Tế bào HT29 được nuôi cấy trên môi trường DMEM/low glucose có chứa 10% FBS, 100 U/mL penicillin, và 0,1 mg/mL streptomycin trong tủ nuôi cấy vô trùng ở 37°C, 5% CO2.
2.2.3.3. Phương pháp đánh giá độc tính của nano astaxanthin trên dòng tế bào HT29 và HepG2 dòng tế bào HT29 và HepG2
Độc tính của nano astaxanthin ở các nồng độ khác nhau (0, 10, 20, 50, 100 và 500 µg/mL) trên các dịng tế bào HT29 và HepG2 được phân tích theo phương pháp Trypan Blue [79]. Thu nhận dịch huyền phù tế bào trong 1ml môi trường. Nhuộm 10μL dịch tế bào với 10μL Trypan Blue 0,2% (Sigma- Aldrich, Singapo), theo tỷ lệ 1:1. Đưa 10μL dung dịch vào buồng đếm hồng cầu. Đếm số tế bào sống và chết trung bình ở 4 góc, mỗi góc gồm 16 ơ vng nhỏ. Sử dụng cơng thức tính số tế bào:
Số tế bào/ml = Trung bình số tế bào đếm được ở 4 góc x 10.000 x N Trong đó N = 2 là tỷ lệ pha loãng 2 lần với Trypan Blue.
Tỷ lệ tế bào sống có trong mẫu được xác định như sau:
Tỷ lệ tế bào sống (%) = (Số tế bào sống/Tổng số tế bào) x 100%.
2.2.3.4. Phương pháp xác định sự hấp thu của tế bào đối với nano astaxanthin astaxanthin
Tế bào HT29 được nuôi trong đĩa 6 giếng bằng môi trường DMEM với mật độ 1×106 tế bào mỗi giếng. Sau 24 h nuôi cấy, tế bào HT29 không được ủ hoặc được ủ với astaxanthin tự do (5 µg/mL), nano-astaxanthin (100 µg/mL với hàm lượng astaxanthin chiếm 5µg/mL) hoặc mẫu trắng (là mẫu nano khơng có chứa astaxanthin; 100 µg/mL) trong thời gian 24h. Sau thời gian đó, rửa lớp tế bào ba lần với nước muối đệm phosphat (PBS, pH 7,4) lạnh. Các tế bào được thu bằng cách ly tâm ở tốc độ 2000 vòng/phút trong 3 phút và giữ ở -20 ºC cho đến khi sử dụng.
Để tách chiết astaxanthin từ tế bào, 5 mL dimethyl sulfoxide (DMSO) được trộn với 20 mg tế bào và nghiền với cát thủy tinh để phá vỡ tế bào [78]. Hỗn hợp được đun nóng ở 50 °C trong 20 phút trong nồi cách thủy và sau đó ly tâm ở 4000 vịng/phút trong 5 phút. Hút các dịch phía trên và chuyển sang ống eppendorf mới. Bước này được lặp đi lại cho đến khi màu của tế bào trở nên nhạt. Tất cả dịch phía trên được trộn vào với nhau và cơ đặc đến 100 µL và astaxanthin được phân tích trên hệ sắc ký lỏng cao áp sử dụng của hãng Agilent HPLC 1260 series với bơm tứ cực G1311C, bộ bơm mẫu tự động G2260A, bộ điều nhiệt cột G1316A, đầu dò DAD G1315D. Cột XDB-C18 (150 mm ì 4.6 mm, 5 àm; Agilent Co.) với đầu bảo vệ cột guard column (3.9
mm × 20 mm, C18, 5 µm). Hệ dung mơi rửa giải bao gồm hai hệ chính là A (dung mơi methanol) và B (nước + 0.1% formic acid). Hệ phân tích rửa giải với tốc độ dịng từ: 0.5 mL/phút. Giải sóng UV qt từ 200 đến 400 nm, giải sóng UV-VIS quét từ 400 đến 800 nm. Quy trình sắc ký phổ và xử lý kết quả phổ được thực hiện trên phần mềm chuyên dụng của hãng Agilent. Độ hấp thụ của các pic rửa giải được ghi lại ở bước sóng 265 nm. Astaxanthin chuẩn được cung cấp bởi hãng Energy Chemicals. Độ tinh khiết của mẫu chuẩn đạt trên 98% được xác định dựa trên phương pháp phân tích sắc ký lỏng cao áp (HPLC). Phương pháp xác định hàm lượng astaxanthin được tiến hành tại phịng Hóa học phân tích, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Hiệu suất hấp thụ của tế bào được tính tốn theo cơng thức sau: H (%) = WS/WT x 100%
Trong đó WS là lượng nano astaxanthin trong tế bào và WT là tổng astaxanthin trong môi trường nuôi cấy tế bào.
2.2.3.5. Phương pháp đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào của nano astaxanthin chống lại stress oxy hóa do H2O2 gây ra trong tế bào HepG2
Đánh giá khả năng bảo vệ tế bào HepG2 chống lại stress oxy hóa do H2O2 gây ra của nano astaxanthin được thực hiện theo phương pháp của Wang và cộng sự [80]. Đầu tiên các tế bào HepG2 được nuôi cấy 24 h trong môi trường DMEM/high glucose trong đĩa nuôi cấy loại 6 giếng với mật độ 1 x 106 tế bào/giếng. Sau 24 h nuôi cấy, tế bào được ủ với nano astaxanthin hoặc mẫu trắng với nồng độ từ 100 µg/mL trong 24 h tiếp theo. Sau thời gian ủ với nano astaxanthin hoặc mẫu trắng, tế bào tiếp tục được ủ dung dịch H2O2 (5 mM) trong 1 giờ. Tác dụng bảo vệ của các nano astaxanthin chống lại sự phá hủy của stress oxy hóa đối với tế bào HepG2 được biểu thị bằng tỷ lệ sống sót của tế bào. Khả năng sống sót của tế bào được xác đinh theo phương pháp Trypan Blue của Crowley và cộng sự [79].
2.2.3.6. Phương pháp đánh giá tác dụng giảm lipit của nano astaxanthin trên dòng tế bào HepG2 astaxanthin trên dòng tế bào HepG2
Các tế bào HepG2 được nuôi cấy 24 h trên môi trường DMEM/ high glucose trong đĩa nuôi cấy loại 24 giếng với mật độ 1 x 105 tế bào/giếng. Sau 24 h nuôi cấy, tế bào HepG2 được cảm ứng gây rối loạn chuyển hóa lipit bằng
cách ủ với mơi trường DMEM có chứa axit oleic 800 M pha trong 0,5%
fatty acid-free BSA trong thời gian 6 h.
Tế bào được cảm ứng gây tích tụ lipit sau đó được ủ với thuốc điều trị giảm mỡ máu (fenofibrate; 50 M), nano astaxanthin hoặc mẫu trắng (10, 50 và 100 µg/mL) trong thời gian 24 h. Nước cất vô trùng được sử dụng như là đối chứng. Mỗi cơng thức thí nghiệm lặp lại 3 lần. Sau thời gian ủ với fenofibrate, nano astaxanthin hoặc mẫu trắng, thu tế bào và xác định hàm lượng lipit.
2.2.3.7. Phương pháp nhuộm lipit bằng Oil Red O (ORO)
Phương pháp nhuộm lipit bằng ORO được thực hiện theo như mô tả của Hoang và cộng sự [81]. Cụ thể: Tế bào HepG2 sau khi được ủ với nano astaxanthin hoặc mẫu trắng được rửa 2 lần với PBS và cố định với 10% (v/v) formalin ở nhiệt độ phòng trong thời gian 10 phút. Sau đó, loại bỏ phần dịch trên và bổ sung formalin 37% (v/v) trong 1 h ở nhiệt độ phòng. Tiếp theo, mẫu được rửa lại 2 lần với nước cất và bổ sung isopropanol 60% trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. Cuối cùng, loại bỏ phần dịch trên, làm khô mẫu bằng máy sấy. Các tế bào sau đó được nhuộm với dung dịch Oil Red O trong 60 phút. Rửa các dung dịch nhuộm thừa bằng nước cất. Chụp ảnh tế bào sau khi nhuộm lipit bằng máy ảnh Canon IXY digital 70 (Canon, Tokyo, Nhật Bản). Định lượng lipit nội bào bằng cách hòa tan các tế bào được nhuộm Oil Red O trong isopropanol 100% và đo mật độ quang ở bước sóng 500 nm trên máy quang phổ Hitachi U-1100 (Hitachi Ltd., Tokyo, Nhật Bản).
2.2.3.8. Phương pháp phân tích hàm lượng lipit
Tế bào HepG2 sau khi được ủ với nano astaxanthin hoặc mẫu trắng sẽ được rửa 2 lần với PBS. Sau đó, chiết lipit nội bào bằng hỗn hợp dung mơi n- hexane: isopropanol (2:1, v:v) trong thời gian 30 phút theo như mô tả của Hoang và cộng sự [81]. Dung dịch chứa lipit được làm bay hơi bằng máy speed-vac và hòa tan trở lại trong 100 μL ethanol.
Hàm lượng cholesterol và triglyceride nội bào sẽ được xác định bằng phương pháp enzym trên máy phân tích tự động Olympus AU400 (Olympus Analyzers, Tokyo, Nhật Bản). Protein tổng số được xác định với kít Bradford protein assay (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) và bovine serum albumin được sử dụng làm chất chuẩn để chuẩn hóa hàm lượng protein. Hàm lượng
cholesterol và triglyceride trong tế bào sau đó sẽ được chuẩn hóa với nồng độ của protein tổng số theo công thức sau:
Hàm lượng lipit tổng số Hàm lượng lipit trong tế bào =
(mmol/L/mg protein) Hàm lượng protein tổng số
2.2.2.9. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý thống kê theo phương pháp Student’s t-test bằng phần mềm E-xcel.
2.2.4 Địa điểm tiến hành các thí nghiệm trong nghiên cứu
Địa điểm tiến hành các thí nghiệm và phân tích các kết quả trong nghiên cứu được trình bày trong Bảng 2.2.
Bảng 2.2. Địa điểm tiến hành nghiên cứu
TT Nội dung thực hiện Địa điểm thực hiện
1. Nghiên cứu hình thái và sự phân bố kích thước hạt của nano astaxanthin
Xác định hình thái của nano astaxanthin
Phịng thí nghiệm trọng điểm Quốc gia vật liệu polyme và compozit, Trường Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh
Nghiên cứu sự phân bố kích thước hạt (DLS) của nano astaxanthin.
Phòng Vật liệu tiên tiến, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
2. Đánh giá hoạt tính sinh học của nano astaxanthin
Hoạt tính khử gốc DPPH của astaxanthin và nano astaxanthin
Phịng Cơng nghệ tảo, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam
Độc tính tế bào của nano astaxanthin
Phịng Cơng nghệ tảo, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Khả năng hấp thu nội bào của nano astaxanthin
Phịng Cơng nghệ tảo, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Tác dụng bảo vệ tế bào HepG2 của nano astaxanthin chống lại tổn thương bởi stress oxy hóa do H2O2 gây ra
Phịng Cơng nghệ tảo, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Tác dụng giảm lipit của nano astaxanthin
Phịng Cơng nghệ tảo, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO NANO ASTAXANTHIN
3.1.1 Ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt tới quá trình chế tạo nano astaxanthin nano astaxanthin
Ảnh hưởng của tỷ lệ chất hoạt động bề mặt cremophor RH40/hoạt chất astaxanthin tới sự hình thành hạt nano astaxanthin đã được khảo sát. Hình 3.1 là kết quả đo phân bố kích thước hạt của các mẫu nano astaxanthin chế tạo được. 0 50 100 150 200 250 300 350 400 0 2 4 6 8 10 12 D is tr ib u ti o n ( % ) Particle diameter (nm) A1 A2 A3
Hình 3.1. Giản đồ phân bố kích thước hạt của nano astaxanthin theo các tỷ lệ
khác nhau giữa astaxanthin và chất hoạt động bề mặt cremorphor RH40 Các mẫu A1, A2, A3 với tỷ lệ hàm lượng astaxanthin/cremophor RH40 là 1/1 (A1), 1/2 (A2), và 1/3 (A3) cho kết quả đường kính hạt trung bình lần lượt là 115 nm, 90 nm và 85 nm. Nhận thấy, khi giảm tỷ lệ hàm lượng astaxanthin/RH40 thì đường kính hạt trung bình của các mẫu giảm, đặc biệt khi giảm tỷ lệ 1/1 xuống 1/2 tức hàm lượng chất hoạt động bề mặt tăng gấp
đơi so với hoạt chất thì kích thước hạt giảm xuống đáng kể, từ 115 nm xuống 90 nm. Tiếp tục giảm tỷ lệ hàm lượng astaxanthin/cremophor RH40 từ 1/2 xuống 1/3 thì xu hướng kích thước hạt nano giảm không đáng kể. Theo một số nghiên cứu, hàm lượng chất hoạt động bề mặt khi đưa vào công thức chế tạo hạt nano cần phù hợp để tránh những tác dụng phụ của sản phẩm cuối cùng như tăng mỡ máu hay rối loạn chuyển hóa lipit. Ngồi ra, giản đồ phân bố kích thước hạt cho thấy mẫu A2 có sự phân bố hẹp và kích thước hạt trung bình dưới 100 nm. Như vậy, kết quả cho thấy vai trò trong việc tạo hạt nano astaxanthin của chất hoạt động bề mặt cremophor RH40 và tỷ lệ astaxanthin/chất hoạt động bề mặt là 1/2 được lựa chọn cho công thức nano astaxanthin.
Để đánh giá hiệu quả của các chất hoạt động bề mặt khác nhau tới quá trình chế tạo hạt nano astaxanthin, chúng tôi thay thế RH40 bằng tween 80 với tỷ lệ astaxanthin/tween 80 là 1/2 (A4) là tỷ lệ đã đạt được kích thước hạt nano tốt dưới 100 nm. 0 50 100 150 200 250 300 350 0 2 4 6 8 10 12 Di s tr ibu ti on ( %) Particle diameter (nm) A2 A4
Hình 3.2. Giản đồ phân bố kích thước hạt của nano astaxanthin sử dụng chất
A1
100nm 100nm
100nm 100nm
A2
A3 A4
Hình 3.2 là kết quả giản đồ phân bố kích thước hạt của nano astaxanthin khi sử dụng chất hoạt động bề mặt cremophor RH40 và tween 80. Các tiểu phân trong mẫu A2, A4 có đường kính trung bình lần lượt là 90 nm và 96 nm. Khơng có sự khác biệt đáng kể giữa 2 mẫu này. Tuy nhiên, mẫu A4 có nhiều hạt tiểu phân lớn hơn, một số hạt có đường kính lên tới gần 200 nm. Mặt khác, cremophor RH40 có độc tính thấp hơn tween 80. Do đó, cremophor RH40 được lựa chọn sử dụng làm chất hoạt động bề mặt cho quá trình chế tạo nano astaxanthin.
3.1.2. Hình thái của các mẫu nano astaxanthin
Hình thái của các mẫu bột nano astaxanthin được đánh giá qua ảnh TEM. Kết quả ảnh TEM của các mẫu A1, A2, A3 và A4 được thể hiện lần lượt trong Hình 3.3.