CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.2 CÔNG NGHỆ NANO VÀ NANOASTAXANTHIN
1.2.3 Các chức năn gy sinh của hệ
1.2.3.1 Chức năng chuẩn đốn (phân tích đặc hiệu, ảnh MRI, ảnh quang)
Nhiều nghiên cứu đã được công bố về việc chế tạo các loại chất tương phản dựa trên hạt nano để chụp ảnh y sinh học. Chẳng hạn, chấm lượng tử được sử dụng để chụp ảnh huỳnh quang. Các hạt nano vàng với hóa học bề mặt phong phú và khả năng hấp thu tốt được sử dụng trong chụp cắt lớp vi tính tia X (Computer tomography – CT). Các hạt nano oxit sắt với kích thước, thành phần chính xác và các hợp chất nano mới của gadolinium đang được nghiên cứu làm tác nhân tương phản cho chụp ảnh cộng hưởng từ hạt nhân (Magnetic Resonance Imaging - MRI) [49].
Đối với chức năng chụp ảnh huỳnh quang, để quan sát được độ thâm nhập vào bên trong tế bào, các phân tử phát huỳnh quang có thể được đính kết vào hệ dẫn thuốc. Việc nối kết các phân tử có khả năng phát huỳnh quang (fluorophore) như fluorescein (phát màu xanh lục) hay rhodamine (phát màu đỏ) vào các tế bào để định vị và quan sát sự phân bố trong những thí nghiệm sinh học đã được thực hiện từ nhiều năm nay [58]. Tuy nhiên, các phân tử huỳnh quang này có cường độ phát quang yếu và bị lu mờ sau vài phút hoạt động. Hơn nữa, việc sử dụng một số chất màu như rhodamine thường có độc tính cao [59]. Do vậy, sử dụng hạt nano với một số chất phát quang thích hợp khác (như curcumin, doxorubicin) sẽ giải quyết được những vấn đề tồn tại nêu trên. Kết hợp chấm lượng tử trên hạt nano từ cũng cho phép thực hiện chức năng quang học tương tự. Trong cùng một điều kiện kích hoạt, hạt nano có thể tỏa sáng gấp 20 lần phân tử huỳnh quang và giữ độ sáng liên tục không bị lu mờ theo thời gian. Việc phát quang tạo ảnh giúp người quan sát nhìn thấy tế bào ở vùng sâu bên trong cơ thể và ước lượng được mật độ kết tập và phân bố của hệ mang thuốc tại một "địa chỉ" nào đó [60].
1.2.3.2 Chức năng điều trị
Chức năng điều trị của vật liệu nano được thực hiện với nhiều đặc trưng [49]:
- Cải thiện khả năng điều trị của thuốc bằng cách tăng hiệu quả và/hoặc giảm độc tính đối với tế bào thường.
- Đưa dược chất đến mục tiêu là các mô, tế bào hoặc cơ quan cụ thể. - Tăng cường các tính chất của dược chất (ví dụ: sự ổn định, độ tan, thời gian lưu thơng trong máu và khả năng tích tụ tại khối u).
- Kích hoạt sự phóng thích thuốc kéo dài hoặc phóng thích thuốc dưới tác động của mơi trường sinh lý khối u.
- Tạo thuận lợi cho việc mang các dạng thuốc sinh học phân tử (ví dụ DNA, RNA (siRNA) nhỏ, mRNA và protein) đến các điểm hoạt động nội bào.
- Đồng phối hợp nhiều thuốc để cải thiện hiệu quả điều trị và chống kháng thuốc.
- Vận chuyển thuốc qua các hàng rào sinh học (ví dụ, đường tiêu hóa và hàng rào máu - não).
- Hiển thị các điểm phân phối thuốc bằng cách kết hợp các tác nhân trị liệu với chẩn đốn hình ảnh và/hoặc các phản hồi thời gian thực về tính hiệu quả của dược chất.
- Cung cấp các phương pháp tiếp cận mới cho việc phát triển vắc xin tổng hợp.
- Kết hợp tính chất điều trị vốn có của một số vật liệu nano (ví dụ: nano vàng hoặc nano sắt oxit khi được kích thích phù hợp).
1.2.4. Các phương pháp chế tạo vật liệu nano
Để tổng hợp hạt nano nói chung và hạt nano trong y dược nói riêng gồm có hai phương pháp: bottom-up (từ dưới lên) và top-down (từ trên xuống) [61,62].
1.2.4.1 Phương pháp từ dưới lên
Phương pháp bottom-up là phương pháp hình thành hạt nano từ các phần tử kích thước nhỏ (ion, nguyên tử, phân tử hoặc tiểu phân nhỏ), liên kết chúng thành các tiểu phân kích thước lớn hơn trong mơi trường phân tán nhờ các liên kết hóa lý. Để thu được hạt ở kích thước nano với hình dạng cấu trúc mong muốn, chúng ta có thể điều chỉnh các điều kiện lý hoá và xúc tác trong quá trình phát triển cấu trúc và tránh tạo ra các phân tử có kích thước lớn cỡ µm. Phương phương bottom – up bao gồm các phương pháp sau:
- Phương pháp hóa ướt (wet chemical methods)
Phương pháp hóa ướt gồm có phương pháp thủy nhiệt, sol-gel, và đồng kết tủa [63]. Theo phương pháp này, các dung dịch chứa ion khác nhau được trộn với nhau theo một tỷ phần thích hợp, dưới tác động của nhiệt độ, áp suất, điều kiện pH… mà các vật liệu nano được kết tủa từ dung dịch. Sau các quá trình lọc, sấy khơ, ta thu được các vật liệu có kích thước nano.
Ưu điểm của phương pháp hóa ướt là các vật liệu có thể chế tạo được rất đa dạng, chúng có thể là vật liệu vô cơ, hữu cơ, kim loại. Đặc điểm của phương pháp này là rẻ tiền và có thể chế tạo được một khối lượng lớn vật liệu nhưng nó cũng có nhược điểm là các hợp chất có liên kết với phân tử nước có thể là một khó khăn, phương pháp sol-gel khơng có hiệu suất cao, sản phẩm không đồng nhất.
- Phương pháp bốc bay nhiệt (thermal evaporation method)
Gồm các phương pháp quang khắc (lithography), bốc bay trong chân không (vacuum deposition) vật lí, hóa học. Các phương pháp này áp dụng hiệu quả trong chế tạo màng mỏng hoặc lớp bao phủ bề mặt, người ta cũng có thể dùng nó để chế tạo hạt nano bằng cách cạo vật liệu nano từ tấm chắn [64]. Tuy nhiên, phương pháp này khơng hiệu quả để có thể chế tạo vật liệu ở quy mô thương mại.
- Phương pháp hình thành từ pha khí (gas-phase method)
Gồm các phương pháp nhiệt phân (flame pyrolysis), nổ điện (electro- explosion), đốt laser (laser ablation method), bốc bay nhiệt độ cao, plasma [64]. Nguyên tắc của các phương pháp này là hình thành vật liệu nano từ pha khí. Nhiệt phân là phương pháp có từ rất lâu, được dùng để tạo các vật liệu đơn giản như carbon, silicon. Phương pháp đốt laser có thể tạo được nhiều loại vật liệu nhưng lại chỉ giới hạn trong phịng thí nghiệm vì hiệu suất của chúng thấp. Phương pháp plasma một chiều và xoay chiều có thể dùng để tạo rất nhiều vật liệu khác nhau nhưng lại khơng thích hợp để tạo vật liệu hữu cơ vì nhiệt độ của nó có thể đến 90000C.
1.2.4.2 Phương pháp từ trên xuống
Công nghệ top-down thường bắt đầu từ các tinh thể hoặc phần tử có kích thước cỡ µm trở lên và làm giảm kích thước đến cỡ nano. Bao gồm các
phương pháp tán, nghiền, hợp kim cơ học [61]. Theo phương pháp này, vật liệu ở dạng bột được nghiền đến kích thước nhỏ hơn. Ngày nay, các máy nghiền thường dùng là máy nghiền kiểu hành tinh hay máy nghiền quay. Phương pháp cơ học có ưu điểm là đơn giản, dụng cụ chế tạo khơng đắt tiền và có thể chế tạo với một lượng lớn vật liệu. Tuy nhiên, nó lại có nhược điểm là các hạt bị kết tụ với nhau, phân bố kích thước hạt khơng đồng nhất, dễ bị nhiễm bẩn từ các dụng cụ chế tạo và thường khó có thể đạt được hạt có kích thước nhỏ. Phương pháp này thường được dùng để tạo vật liệu không phải là hữu cơ như kim loại.
1.2.4.3 Phương pháp kết hợp
Trong thực tế, điều chế hệ tiểu phân nano thường kết hợp giữa hai phương pháp trên. Phương pháp từ dưới lên tạo hệ tiểu phân thơ, sau đó phân tán giảm kích thước để thu được hệ tiểu phân nano [61]. Chẳng hạn, điều chế hệ tiểu phân liposome bằng kỹ thuật tạo lớp màng phim lipit kép rồi hydrat hóa tạo hệ liposome MLV hoặc LUV kích thước ở hàng micromet. Để giảm kích thước xuống hàng nanomet, sử dụng các kỹ thuật phân tán như siêu âm, đùn ép, đồng nhất hóa.
Trong các phương pháp nano để bào chế thuốc và thực phẩm chức năng, phương pháp đơn giản nhất là tạo hỗn hợp dầu, dung môi và chất hoạt động bề mặt. Các phương pháp tương tự cũng có thể tạo hệ nano như nano nhũ tương, huyền phù, dung mơi và nhũ tương cơ quay. Đồng hố nóng hoặc đồng hố áp suất cao, vi nang, siêu âm, sấy phun, .… tạo các hệ nano bằng các kỹ thuật thường được sử dụng để sản xuất quy mơ lớn. Ngồi ra, một số kỹ thuật phức tạp hơn có thể được ứng dụng để tạo hệ nano như lắng đọng, nghiền quay, quay điện, tạo sợi nano, v.v… [65].
1.2.5. Tình hình nghiên cứu về nano astaxanthin
Để tăng tối đa khả năng hấp thụ cũng như là bảo vệ hoạt tính đầy tiềm năng của astaxanthin, rất nhiều phương pháp đã được áp dụng như công nghệ nano, biến đổi cấu trúc, tạo phức chất vùi... Trong đó, cơng nghệ nano mang lại hiệu quả vượt trội hơn cả trong việc nâng cao độ phân tán, cải thiện sự hấp thu vào trong tế bào, giảm chuyển hóa tại gan, giữ ổn định nồng độ trong máu, giúp tăng cường dược tính của hoạt chất [66]. Tiểu phân nano được thiết kế phù hợp với đường đi của thuốc bên trong cơ thể, có khả năng giúp vận
chuyển thuốc đến đúng vị trí cần giải phóng hoạt chất hoặc đích sinh học (mơ bệnh, tế bào bệnh hoặc bào quan bên trong tế bào bệnh). Trên đường vận chuyển đến đích, các hoạt chất kém bền như astaxanthin được bao bọc bên trong tiểu phân nano sẽ tránh được các tác nhân phân hủy như: nhiệt độ, độ ẩm, oxy, khơng khí và ánh sáng, pH, dịch sinh lý, enzyme. Đồng thời, tiểu phân nano sẽ tránh được sự phân bố thuốc đến các mô lành và tế bào lành.
Năm 2011, Meor Mohd Affandi và nhóm nghiên cứu đã chế tạo thành công nano nhũ tương bằng phương pháp ly tâm tốc độ cao 9000 vòng/phút ở áp suất 800 bars. Nhũ tương nano astaxanthin bao gồm các thành phần: 4% w/w chất hoạt động bề mặt, 2% w/w astaxanthin, 14% w/w dầu và 80% w/w nước. Sản phẩm nano thu được có kích thước là 150-160 nm, dễ hịa tan trong nước và có khả năng tăng hoạt tính sinh học mà khơng thay đổi cấu trúc hóa học của astaxanthin [67].
Trong thí nghiệm nghiên cứu tác dụng bảo vệ da do tia cực tím của nano astaxanthin, astaxanthin tan trong dầu và lutein của Harada và cộng sự năm 2017 đã cho thấy, chuột được uống nano astaxanthin có tác dụng giảm viêm, giảm số lượng tế bào niêm mạc bị chết cùng với giảm mức độ biểu hiện của các gen COX-2, p-IκB-α, TNFα và CD45 cao nhất khi so sánh với các
nhóm chuột được uống astaxanthin pha trong dầu và lutein [68]. Nghiên cứu chứng minh rằng nano astaxanthin có hiệu quả trong việc bảo vệ bề mặt mắt chống lại các tác động có hại của việc tiếp xúc với tia UVB cấp tính, mà khơng có tác dụng phụ bất lợi rõ ràng nào được quan sát thấy. Nano astaxanthin tạo ra một chất hịa tan trong nước có nguồn gốc tự nhiên đầy hứa hẹn để bảo vệ chống lại tổn thương bề mặt mắt trong điều kiện căng thẳng oxy hóa cao khi sử dụng theo đường uống.
Chengzhen Liu và cộng sự (2019) đã nghiên cứu chế tạo astaxanthin bao bọc trong các hạt nano poly (axit lactic-co-glycolic) (PLGA) và chitosan oligosaccharides (COS). Sự bao bọc tốt của các hạt nano PLGA và COS đã cho kết quả sản phẩm nano chứa astaxanthin có dạng hình cầu, kích thước hạt trung bình khoảng 150 nm. Hiệu suất bao bọc (> 85%) và khả năng tải (> 15%) của astaxanthin trong các hạt nano là tương đối cao. Phân tích tia X cho thấy rằng astaxanthin được bao bọc ở dạng vơ định hình. Các hạt nano có khả năng phân tán tốt và ổn định trong dung dịch nước và có khả năng tương thích tế bào cao [69].
Cũng trong năm 2019, Guan và cộng sự (2019) cũng đã chế tạo thành công sản phẩm nano chứa astaxanthin bằng phương pháp đông khô. Bột nano cho khả năng phân tán rất tốt trong nước. Tuy nhiên hàm lượng astaxanthin có trong sản phẩm tương đối thấp chỉ 2,9%. Kết quả thử nghiệm trên chuột cho thấy với liều uống là 2,4 mg/kg, sau 28 ngày sử dụng liên tiếp khơng có độc tính [70].
Trong nghiên cứu của Sun và cộng sự (2019), nhũ tương nano astaxanthin không chứa nước (ASX-NANE) được chế tạo bằng phương pháp đồng nhất áp suất cao. Sản phẩm kết hợp các ưu điểm của chất mang nano và nhũ tương không chứa nước. ASX-NANE thu được có dạng hình cầu với sự phân bố kích thước đồng đều và hiệu suất bám cao (98,4 ± 0,3%). Phân tích FTIR chỉ ra rằng astaxanthin đã được bao bọc thành công vào lõi lipit của ASX-NANE. Hệ nano nhũ tương này có tính ổn định trong khoảng thời gian 4 tuần ở 25°C và có thể bảo vệ astaxanthin chống lại sự oxy hóa. Nghiên cứu tế bào in vitro cho thấy ASX-NANE có độc tính thấp và có thể bảo vệ tế bào chống lại stress oxy hóa. Nghiên cứu thẩm thấu trong ống nghiệm và các phần mô học da cho thấy sự thẩm thấu tăng cường của astaxanthin và sự biến đổi của lớp sừng với sự hấp thụ tồn thân thấp và biểu bì khơng thay đổi. Do đó, nhũ tương nano khơng chứa nước có thể là một chiến lược thích hợp để sản xuất chế phẩm astaxanthin bôi tại chỗ [71].
Bằng phương pháp nhũ hóa - bay hơi, Hyeryeon Oh và cộng sự (2020) đã chế tạo astaxanthin lecithin nano-liposol (ASTA @ Lec NS) có kích thước 169-187 nm và chỉ số đa phân tán <0.3. ASTA @ Lec NS ổn định trong một thời gian đủ dài và dễ dàng đông khơ thành bột khi thêm một lượng sucrose thích hợp. Ngồi ra, khả năng hịa tan trong nước tốt của ASTA @ Lec NS đã cải thiện đáng kể sinh khả dụng của astaxanthin. Sản phẩm ASTA @ Lec NS có thể loại bỏ các gốc tự do (ROS) và thúc đẩy quá trình chữa lành vết thương của các tế bào NIH 3T3 (nguyên bào sợi) hiệu quả hơn mà khơng gây ra bất kỳ độc tính tế bào nào. Kết quả nghiên cứu đã khẳng định khả năng chống oxy hóa tại chỗ và in vitro của ASTA@Lec NS đều cao hơn so với
astaxanthin tinh khiết và lecithin [72].
Ở nước ta, các nghiên cứu về bào chế dạng nano của các hoạt chất có hoạt tính sinh học đang được quan tâm và phát triển trong những năm gần đây. Tuy nhiên, việc nghiên cứu chế tạo dạng nano astaxanthin nói riêng cho
tới thời điểm hiện tại là rất ít. Liên quan tới hoạt chất này, tại Việt Nam mới chỉ triển khai nghiên cứu chiết tách astaxanthin từ các nguồn nguyên liệu khác nhau, trong đó các nghiên cứu đều đưa ra kết luận: Vi tảo Haematococcus
pluvialis là nguồn nguyên liệu cho hàm lượng tích lũy astaxanthin cao nhất và
sản phẩm astaxanthin thu được có khả năng ứng dụng sử dụng được cho con người. Thị trường trong nước hiện nay hầu hết các sản phẩm chứa nano astaxanthin đều là nhập ngoại với giá thành cao, riêng chỉ có cơng ty Nano Việt Nam Technology cho ra sản phẩm dung dịch nano astaxanthin. Tuy nhiên, sản phẩm này chưa đáp ứng các tiêu chuẩn cơ sở của dược liệu do đó khả năng ứng dụng mới chỉ áp dụng trong nuôi trồng thủy sản. Cụ thể là tăng sức đề kháng cho tôm mẹ.
CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Astaxanthin (90%) được tách chiết từ vi tảo lục Haematococcus pluvialis do phịng Cơng nghệ tảo, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm
Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam cung cấp.
2.1.2. Các dịng tế bào
- Tế bào ung thư đại tràng HT29 có nguồn gốc từ Bộ mơn Sinh học tế bào, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
- Dòng tế bào gan ung thư HepG2 nguồn gốc từ phòng Thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.1.3 Hóa chất
- Các hóa chất sử dụng chế tạo nano astaxanthin: Dung môi Dichloromethane; Tween 80 (Polysorbate 80; Sigma-Aldrich), cremophor RH40 (Sigma-Aldrich), copolyme polylactid-polyetylen glycol (PLA-PEG) đã được tổng hợp từ nghiên cứu trước đây [73] có khối lượng phân tử Mw là 8400, với chỉ số PDI là 1,2.
- Các hóa chất dùng để nuôi cấy tế bào: môi trường nuôi cấy Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), DMEM/high glucose, Fetal bovine serum (FBS), bovine serum albumin, penicillin, và streptomycin (Invitrogen, Mỹ), Fenofibrate (C20H21ClO4, Sigma F6020), Oil Red O (C26H24N4O, Sigma O0625), acid oleic (OA), isopropanol (Trung Quốc);
- Hóa chất dùng để xác định hoạt tính chống oxy hóa: DPPH (1,1-