CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.3.4. Phương pháp xác định sự hấp thu của tế bào đối với nanoastaxanthin
dòng tế bào HT29 và HepG2
Độc tính của nano astaxanthin ở các nồng độ khác nhau (0, 10, 20, 50, 100 và 500 µg/mL) trên các dịng tế bào HT29 và HepG2 được phân tích theo phương pháp Trypan Blue [79]. Thu nhận dịch huyền phù tế bào trong 1ml môi trường. Nhuộm 10μL dịch tế bào với 10μL Trypan Blue 0,2% (Sigma- Aldrich, Singapo), theo tỷ lệ 1:1. Đưa 10μL dung dịch vào buồng đếm hồng cầu. Đếm số tế bào sống và chết trung bình ở 4 góc, mỗi góc gồm 16 ơ vng nhỏ. Sử dụng cơng thức tính số tế bào:
Số tế bào/ml = Trung bình số tế bào đếm được ở 4 góc x 10.000 x N Trong đó N = 2 là tỷ lệ pha loãng 2 lần với Trypan Blue.
Tỷ lệ tế bào sống có trong mẫu được xác định như sau:
Tỷ lệ tế bào sống (%) = (Số tế bào sống/Tổng số tế bào) x 100%.
2.2.3.4. Phương pháp xác định sự hấp thu của tế bào đối với nano astaxanthin astaxanthin
Tế bào HT29 được nuôi trong đĩa 6 giếng bằng môi trường DMEM với mật độ 1×106 tế bào mỗi giếng. Sau 24 h nuôi cấy, tế bào HT29 không được ủ hoặc được ủ với astaxanthin tự do (5 µg/mL), nano-astaxanthin (100 µg/mL với hàm lượng astaxanthin chiếm 5µg/mL) hoặc mẫu trắng (là mẫu nano khơng có chứa astaxanthin; 100 µg/mL) trong thời gian 24h. Sau thời gian đó, rửa lớp tế bào ba lần với nước muối đệm phosphat (PBS, pH 7,4) lạnh. Các tế bào được thu bằng cách ly tâm ở tốc độ 2000 vòng/phút trong 3 phút và giữ ở -20 ºC cho đến khi sử dụng.
Để tách chiết astaxanthin từ tế bào, 5 mL dimethyl sulfoxide (DMSO) được trộn với 20 mg tế bào và nghiền với cát thủy tinh để phá vỡ tế bào [78]. Hỗn hợp được đun nóng ở 50 °C trong 20 phút trong nồi cách thủy và sau đó ly tâm ở 4000 vịng/phút trong 5 phút. Hút các dịch phía trên và chuyển sang ống eppendorf mới. Bước này được lặp đi lại cho đến khi màu của tế bào trở nên nhạt. Tất cả dịch phía trên được trộn vào với nhau và cơ đặc đến 100 µL và astaxanthin được phân tích trên hệ sắc ký lỏng cao áp sử dụng của hãng Agilent HPLC 1260 series với bơm tứ cực G1311C, bộ bơm mẫu tự động G2260A, bộ điều nhiệt cột G1316A, đầu dò DAD G1315D. Cột XDB-C18 (150 mm ì 4.6 mm, 5 àm; Agilent Co.) với đầu bảo vệ cột guard column (3.9
mm × 20 mm, C18, 5 µm). Hệ dung mơi rửa giải bao gồm hai hệ chính là A (dung mơi methanol) và B (nước + 0.1% formic acid). Hệ phân tích rửa giải với tốc độ dịng từ: 0.5 mL/phút. Giải sóng UV qt từ 200 đến 400 nm, giải sóng UV-VIS quét từ 400 đến 800 nm. Quy trình sắc ký phổ và xử lý kết quả phổ được thực hiện trên phần mềm chuyên dụng của hãng Agilent. Độ hấp thụ của các pic rửa giải được ghi lại ở bước sóng 265 nm. Astaxanthin chuẩn được cung cấp bởi hãng Energy Chemicals. Độ tinh khiết của mẫu chuẩn đạt trên 98% được xác định dựa trên phương pháp phân tích sắc ký lỏng cao áp (HPLC). Phương pháp xác định hàm lượng astaxanthin được tiến hành tại phịng Hóa học phân tích, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Hiệu suất hấp thụ của tế bào được tính tốn theo cơng thức sau: H (%) = WS/WT x 100%
Trong đó WS là lượng nano astaxanthin trong tế bào và WT là tổng astaxanthin trong môi trường nuôi cấy tế bào.
2.2.3.5. Phương pháp đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào của nano astaxanthin chống lại stress oxy hóa do H2O2 gây ra trong tế bào HepG2
Đánh giá khả năng bảo vệ tế bào HepG2 chống lại stress oxy hóa do H2O2 gây ra của nano astaxanthin được thực hiện theo phương pháp của Wang và cộng sự [80]. Đầu tiên các tế bào HepG2 được nuôi cấy 24 h trong môi trường DMEM/high glucose trong đĩa nuôi cấy loại 6 giếng với mật độ 1 x 106 tế bào/giếng. Sau 24 h nuôi cấy, tế bào được ủ với nano astaxanthin hoặc mẫu trắng với nồng độ từ 100 µg/mL trong 24 h tiếp theo. Sau thời gian ủ với nano astaxanthin hoặc mẫu trắng, tế bào tiếp tục được ủ dung dịch H2O2 (5 mM) trong 1 giờ. Tác dụng bảo vệ của các nano astaxanthin chống lại sự phá hủy của stress oxy hóa đối với tế bào HepG2 được biểu thị bằng tỷ lệ sống sót của tế bào. Khả năng sống sót của tế bào được xác đinh theo phương pháp Trypan Blue của Crowley và cộng sự [79].