Chƣơng 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.1. Phƣơng pháp cấy chuyền và bảo quản tế bào
Quy trình cấy chuyền tế bào:
AT-MSCs đƣợc nuôi cấy trong bình flask, khi tế bào phát triển đạt 80 - 90% tiến hành cấy chuyền. Loại bỏ dịch nuôi cấy, rửa tế bào bằng PBS, sau đó bổ sung 1ml trypsin 0,05%, ủ ấm tế bào trong tủ ấm CO2 từ 3 - 5 phút. Bổ sung thêm 4 ml DMEM bổ sung 10% FBS và 1% penicililin, hút cho vào ống falcon 15 ml tiến hành ly tâm 1500 vòng/phút trong 5 phút. Loại bỏ dịch nổi, tái huyền phù, tiếp tục bổ sung 5 ml DMEM bổ sung 10% FBS và 1% penicililin vào ống và bổ sung thêm 1 μl bFGF. Cho dung dịch vào bình flask, nuôi cấy trong tủ ấm CO2 (CO2 5%, 37oC)
Quy trình bảo quản tế bào
Loại bỏ dịch nuôi cấy, rửa tế bào bằng PBS 2 lần. Bổ sung 1 ml trypsin 0,05%, ủ ấm tế bào trong tủ ấm CO2 từ 3-5 phút. Bổ sung thêm 4 ml DMEM bổ sung 10% FBS và 1% penicililin, hút cho vào ống falcon 15 ml và tiến hành ly tâm 1500 vòng/phút trong 5 phút. Loại bỏ dịch nổi, bổ sung 1,5 ml cell banker, tái huyền phù; chia vào 3 ống cryotube, mỗi ống 0,5 ml; bảo quản tủ lạnh -80oC.
2.4.2.Khảo sát nồng độ dịch chiết nhau thai heo lên sự tăng sinh tế bào gốc trung mô thu nhận từ mô mỡ ngƣời
2.4.2.1. Phương pháp nuôi cấy tế bào:
Cấy chuyền tế bào từ bình flask vào đĩa đƣờng kính 35 mm. Loại bỏ môi trƣờng nuôi của bình flask, rửa bằng PBS 2 lần, cho vào 1 ml trypsin 0,05%, cho bình flask vào tủ ấm từ 3-5 phút để tế bào bong ra. Bổ sung thêm 4 ml DEM bổ sung 10% FBS và 1% penicililin, tính toán lƣợng tế bào cần thiết bằng cách đếm. Sau đó, cho dung dịch vào ống falcon 15ml tiến hành ly tâm 1500 vòng/phút trong 5 phút ở 4oC. Loại bỏ dịch nổi, tái huyền phù tế bào sau đó bổ sung thêm 12 ml DMEM bổ sung 10% FBS và 1% penicililin. Mật độ tế bào ban đầu là 4x104 tế bào/đĩa nuôi. Mỗi nghiệm thức thực hiện 3 đĩa để tính giá trị trung bình và sai số. Tế bào đƣợc cấy trong các môi trƣờng nuôi có bổ sung nồng độ dịch chiết lần lƣợt nhƣ sau: 50 μg/ml, 100 μg/ml, 150 μg/ml. Cụ thể:
Nghiệm thức 1 (đối chứng): ATMSCs nuôi trong DMEM bổ sung FBS.
Nghiệm thức 2 (đối chứng dƣơng): ATMSCs nuôi trong DMEM bổ sung FBS và bFGF.
Nghiệm thức 3: ATMSCs nuôi trong DMEM bổ sung FBS và sử dụng dịch chiết ở nồng độ 50 μg/mL
Nghiệm thức 4: ATMSCs nuôi trong DMEM bổ sung FBS và sử dụng dịch chiết ở nồng độ 100 μg/mL
Nghiệm thức 5: ATMSCs nuôi trong DMEM bổ sung FBS và sử dụng dịch chiết ở nồng độ 150 μg/mL
2.4.2.2. Phương pháp đếm tế bào:
Loại bỏ môi trƣờng ở các giếng sẽ đếm, rửa bằng PBS 2 lần, bổ sung 200 μl trypsin, cho vào tủ ấm 2 phút để tế bào bong ra. Bổ sung 800 μl DMEM bổ sung 10% FBS và 1% penicililin. Hút ra eppendorf. Mỗi lần đếm lấy 10 μl cho một vi trƣờng của buồng đếm hồng cầu 0,0025 mm3 (phƣơng pháp đếm bằng buồng đếm tế bào cải tiến). Tế bào đƣợc đếm trong vòng 10 ngày và ghi nhận kết quả.
2.4.2.3. Phương pháp biệt hóa tế bào
Quy trình biệt hóa của tế bào gốc trung mô thành tế bào mỡ thực hiện như sau:
- Chuẩn bị môi trƣờng biệt hóa tế bào mỡ gồm: DMEM, 0,2mM indomethacin, 50µ axit ascorbic, 0,5µM dexamethasone.
- Khi tế bào đạt 70-80% diện tích đĩa nuôi, cho vào môi trƣờng cảm ứng biệt hóa, thay môi trƣờng 2 ngày/lần. Theo dõi khả năng biệt hóa sau 2-3 tuần.
- Đánh giá sự tích tụ các giọt mỡ trong bào tƣơng tế bào khi quan sát dƣới kính hiển vi soi nổi, hoặc nhuộm Oil red O, thấy có sự hiển diện các giọt mỡ trong bào tƣơng tế bào. Giọt mỡ thƣờng xuất hiện vào ngày 5-7 sau biệt hóa. Qui trình dựa theo tác giả Shahdadfar A (2005).
Các dấu hiệu khẳng định MSC: Sau từ 3-5 ngày nuôi cấy, thu đƣợc quần thể tƣơng đối thuần nhất. Thông thƣờng để khẳng định là MSC dựa vào các tiêu chí sau:
- Hình thái, đặc điểm: các tế bào có hình dạng thoi dài đặc trƣng.
- Về marker bề mặt: biểu hiện dƣơng tính:CD44, CD9, biểu hiện âm tính: CD34, CD14.
Biệt hóa tế bào gốc trung mô thành tạo cốt bào:
Về lý thuyết, các MSC đƣợc biệt hóa trong môi trƣờng có dexamethasone, ascorbic, β – glycerolphosphatase sẽ biệt hóa thành tạo cốt bào. Sau biệt hóa (biệt hóa thành công) định danh phát hiện yếu tố tạo xƣơng trong tế bào bằng các kỹ thuật đặc hiệu nhƣ nhuộm hóa mô miễn dịch với marker osteocalcin, nhuộm alizarin
red, quan sát tinh thể khoáng dƣới kính hiển vi điện tử quét. Quy trình biệt hóa tiến hành nhƣ sau:
- Chuẩn bị môi trƣờng biệt hóa: là môi trƣờng biệt hóa xƣơng bổ xung 10mM β-glycerolphosphat (sigma), 50µg ascorbate (sigma), 10-7 M dexsamethasone (sigma).
- Nuôi cấy tế bào khi đạt mật độ khoảng 10.000/ cm2 trong lớp đơn.
- Đƣa tế bào vào môi trƣờng biệt hóa. Thay môi trƣờng 2-3 ngày/lần.Thời gian biệt hóa từ 14-21 ngày.
Sau biệt hóa 21 ngày, định danh tế bào. Các kỹ thuật định danh tế bào sau biệt hóa: nhuộm Alizarin red, nhuộm hóa mô miễn dịch với marker osteocalcin, kỹ thuật siêu cấu trúc.