Số lƣợng mẫu bị lão hoá da dựa theo cấu trúc collagen dƣới ảnh hƣởng của thời gian chiếu tia UV đƣợc thể hiện qua biểu đồ hình 3.11.
Hình 3.11. Biểu đồ thể hiện số lƣợng mẫu bị lão hoá da dựa theo cấu trúc collagen dƣới tác động của UV
Từ kết quả số lƣợng mẫu ở từng mức độ lão hoá (xem phụ lục 3.2), quy đổi thành tỉ lệ (%) mức độ lão hoá dƣới ảnh hƣởng của cƣờng độ chiếu ở mỗi nghiệm thức theo phƣơng pháp ở mục 2.4.4, kết quả đƣợc thể hiện qua bảng 3.3.
Bảng 3.3. Tỉ lệ (%) mức độ lão hoá da dƣới ảnh hƣởng của mốc thời gian chiếu
Nghiệm thức Lão hoá mức 0 Lão hoá mức 1 Lão hoá mức 2 Lão hoá mức 3 Đối chứng 60,00% 40,00% 0,00% 0,00% Nghiệm thức 1 33,00% 47,00% 20,00% 0,00% Nghiệm thức 2 6,70% 33,30% 33,30% 26,70% Nghiệm thức 3 3,30% 20,00% 50,00% 26,70%
Từ kết quả biểu đồ hình 3.11 và bảng 3.3, kết quả đánh giá mức độ lão hoá ở các nghiệm thức thông qua cấu trúc collagen đƣợc mô tả tóm tắt nhƣ sau:
Ở nghiệm thức đối chứng (không chiếu UV): trong điều kiện ánh sáng trắng của phòng thí nghiệm (12 giờ sáng :12 giờ tối), sau 8 tuần chỉ có 60% không bị lão hoá da (mức 0), và vẫn có tới 40% chuột có dấu hiệu lão hoá da (mức 1). Nhƣ vậy, trong điều kiện nuôi bình thƣờng, quá trình lão hoá nội tại vẫn diễn ra theo chu trình sống tự nhiên của chuột (chiếm 40%). Kết quả nhuộm HE cho thấy xuất hiện một số đứt gãy trong cấu trúc collagen và mật độ collagen bắt đầu không liên tục. Tuy nhiên, ở nghiệm thức này không có lão hoá da mức 2 và 3; lão hoá mức 1 vẫn dƣới 50%. Kết quả này cho thấy chuột đƣợc nuôi trong điều kiện bình thƣờng, khi đạt 14 tuần tuổi, sự lão hoá do thay đổi cấu trúc collagen là không đáng kể. Điều này giúp cho sự đánh giá ảnh hƣởng của tia UV lên tốc độ lão hoá có tính tin cậy cao.
Ở nghiệm thức 1 (chiếu UV 3 giờ/ngày), kết quả thực nghiệm cho thấy có 33% chuột không bị lão hoá da, trong khi đó có tới 47% chuột bắt đầu có dấu hiệu lão hoá da (mức 1) và 20% chuột bị lão hoá da (mức 2), chƣa thấy mẫu nào có hiện tƣợng lão hoá da nhiều (mức 3). Sự xuất hiện lão hoá mức 2 ở thời gian chiếu UV 3 giờ/ngày có thể khẳng định rằng, việc chiếu tia UV có ảnh hƣởng đến cấu trúc collagen và làm biến đổi cấu trúc này, gây ra hiện tƣợng đứt gãy và mất sự liên kết giữa các sợi collagen với nhau.
Ở nghiệm thức 2 (chiếu UV 6 giờ/ngày), mức độ lão hoá thay đổi rõ rệt so với ở nghiệm thức chiếu 3 giờ/ngày: số lƣợng mẫu không bị lão hoá da (mức 0) chỉ có 6,7%; số lƣợng mẫu có dấu hiệu lão hoá da (mức 1 và mức 2) bằng nhau, đều chiếm 33,33% và đặc biệt, có tới 26,7% mẫu da bị lão hoá nặng (mức 3). Nhƣ vậy, với thời gian chiếu 6 giờ/ngày, chuột bị lão hoá da tăng so với khi chiếu 3 giờ/ngày (33,33% so 20%, tƣơng ứng); sự xuất hiện lão hoá da nặng với tỉ lệ 26,7% chứng tỏ thời gian tiếp xúc với tia UV lâu hơn đã gây ra hiện tƣợng đứt gãy hầu hết cấu trúc collagen ở nhiều mức độ khác nhau. Trong khi đó, với thời gian chiếu 3 giờ/ngày chƣa ghi nhận đƣợc hiện tƣợng lão hoá da nặng (mức 3).
Ở nghiệm thức 3 (chiếu 9 UV giờ/ngày), số lƣợng mẫu không lão hoá da chỉ chiếm một tỉ lệ rất nhỏ (3,30%), trong khi các mức độ lão hoá da (mức 1 và 2) có những biến đổi so với khi chiếu UV 6 giờ/ngày, cụ thể: số lƣợng mẫu có dấu hiệu lão hoá da giảm (20% so với 33,3%), số lƣợng mẫu bị lão hoá da tăng gấp 1,5 lần (50% so với 33,3%). Riêng hiện tƣợng lão hoá da mức độ nặng ở nghiệm thức này không thay đổi so với nghiệm thức chiếu UV 6 giờ/ngày (đều 26,7%). Qua đó có thể thấy, mặc dù với lƣợng thời gian chiếu UV dài hơn (9 giờ/ngày) nhƣng vẫn chƣa tạo sự cách biệt về mức độ lão hoá da nặng so với thời gian chiếu 6 giờ/ngày. Trong khi đó, với thời gian chiếu 6 giờ/ngày cho kết quả mức độ lão hoá da ở các mức
khác nhau tƣơng đối hợp lí. Vì vậy, xét về hiệu quả thí nghiệm và phƣơng diện kinh tế, môi trƣờng, tính hợp lí về khung thời gian thực tế, đề tài chọn thời gian chiếu UV 6 giờ/ngày để tiếp tục khảo sát hiệu quả ngăn ngừa lão hoá da chuột của dịch chiết nhau thai heo ở thí nghiệm 3..
Tóm lại, từ kết quả phân tích trên có thể nhận định: cùng một cƣờng độ (24 mJ/cm2), sự tổn thƣơng lên da chuột có xu hƣớng tăng dần theo sự tăng dần thời gian chiếu (3 giờ, 6 giờ, và 9 giờ chiếu): tăng mức độ lão hoá da bên ngoài (da khô, nếp nhăn nhiều, sự đàn hồi của da giảm dần); độ dày biểu bì sau 6 và 9 giờ chiếu tƣơng đƣơng nhau nhƣng tăng cách biệt so với 3 giờ và 0 giờ chiếu; cấu trúc collagen bị đứt gãy tăng dần; mức độ lão hoá da cũng tăng dần.
3.2.3.Biện luận
Sự tăng độ dày biểu bì do tác động của tia UV: Độ dày biểu bì da chuột tăng
khi tăng thời gian chiếu UV trong ngày: 3 giờ, 6 giờ và 9 giờ chiếu UV. Kết quả này khá tƣơng đồng với công bố của các nghiên cứu: của Yoon Jung Kim và cộng sự (2015), độ dày biểu bì ở da chuột có chiếu UV lớn hơn so với nhóm chuột không đƣợc chiếu UV (p < 0,001); của Lan Wang và cộng sự (2016), độ dày trung bình của biểu bì chuột ở nhóm chiếu UV tăng gấp 4,63 lần so với nhóm không chiếu UV, (15,62 µm) [38]; của Tapan K. Bhattacharyya và cộng sự (2017): độ dày biểu bì ở nhóm chuột đƣợc chiếu UV lớn hơn so với nhóm không chiếu UV (17,7 so với 9,4 µm, p < 0,01) [5]. Độ dày biểu bì da chuột tăng sau khi chiếu UV có thể đƣợc giải thích nhƣ sau: khi tiếp xúc với tiaUV làm cho da tăng độ dày của lớp sừng, đồng thời lớp biểu bì bị sừng hoá quá mức, đây chính là cơ chế để bảo vệ da [6]; sự quang hoá gây ra bởi tia UV là một quá trình tích lũy chất oxy hoá, cơ chế tƣơng tự nhƣ là lão hoá nội tại [39]. Ngoài ra, việc tiếp xúc với tia UV gây ảnh hƣởng đến những thay đổi bên trong cấu trúc da. Đặc biệt, khi da tiếp xúc với UV trong thời gian dài sẽ gây tổn thƣơng DNA, tăng stress oxy hoá, từ đó gây sản sinh ra nhiều gốc oxy hoá tự do (ROS - Reactive oxygen species). Chính điều này làm cho sự sản sinh collagen giảm, tăng cƣờng tổng hợp và hoạt động của maxtrix metallicoprotease (MMP) – chịu trách nhiệm về suy thoái mô liên kết, tích lũy các tế bào bạch cầu, tổng hợp và tích lũy các kiểu hình liên quan đến lão hoá và giảm sự đàn hồi của da. Tất cả những yếu tố này làm xuất hiện nếp nhăn ở da và tăng độ dày biểu bì ở da [40]. Mặt khác, sự tăng độ dày biểu bì da còn là do khi da tiếp xúc với tia UV gây ra phản ứng tế bào phức tạp, chủ yếu là qua trung gian sản xuất ROS. Theo đó, khi có sự gia tăng các phản ứng oxy hoá, yếu tố tăng trƣởng tế bào keratin - một thành phần của yếu tố tăng trƣởng nguyên bào sợi, thúc đẩy tăng trƣởng và
biệt hoá biểu mô và tham gia vào sự sống của tế bào sau chấn thƣơng oxy hoá sẽ tăng hoạt động [41]. chính yếu tố tăng trƣởng này sẽ làm gia tăng lƣợng tế bào keratin để chống tia UV trên các tế bào biểu bì da [42, 43]. Đồng thời, sự gia tăng quá trình phân chia tế bào keratin sau khi tiếp xúc với tia UV cũng dẫn đến sự tích tụ của tế bào keratin, từ đó làm tăng độ dày biểu bì.
Tóm lại, sự gia tăng mức độ tiếp xúc với tia UV (tăng thời gian chiếu) dẫn đến sự tăng độ dày biểu bì, sự gia tăng này phù hợp với đặc điểm sinh lí của chuột để chống lại với tác hại của tia UV nhằm giúp bảo vệ da và cấu trúc dƣới da, chống lại quá trình lão hoá. Tuy nhiên, khi tiếp xúc với tia UV quá lâu sẽ gây tổn thƣơng da và thậm chí gây ung thƣ da.
Sự thay đổi cấu trúc collagen do ảnh hưởng của tia UV: Sự tiếp xúc của da
với tia UV dẫn đến sự phá hủy cấu trúc collagen và tăng mức độ lão hoá da. Sự đứt gãy cấu trúc collagen và mức độ lão hoá da gia tăng khi tăng thời gian tiếp xúc với tia UV.. Kết quả này tƣơng đồng với nghiên cứu của Yoon Jung Kim và cộng sự (2015): tính đa dạng và mật độ của sợi collagen giảm đáng kể ở vùng hạ bì của da ở nhóm chuột bị chiếu UV so với nhóm chuột không chiếu UV (p < 0,01). Nhóm này cho rằng, các MMP đƣợc tiết ra quá mức từ các tế bào keratinocytes bị kích thích bởi tác động của tia UV, các nguyên bào sợi và các tế bào viêm góp phần làm suy giảm ma trận ngoại bào ở da bị chiếu UV [44-46]. Collagenase MMP-1 và MMP-3 đóng một vai trò quan trọng trong việc khởi đầu sự thoái hoá của collagens loại I, III và IV - đây là các thành phần chính của lớp hạ bì ở da [47]. Bên cạnh đó, Gelatinase MMP-9 đóng vai trò chính trong sự thoái hoá cuối cùng của collagen cũng bị phân cắt thành gelatin và các peptide nhỏ, một yếu tố chính chịu trách nhiệm hình thành nếp nhăn [39, 48, 49].
Theo Lan Wang và cộng sự (2016), sau thời gian dài chiếu UV, hàm lƣợng collagen ở nhóm có chiếu UV giảm rõ rệt so với nhóm đối chứng (p < 0,05). Trong lớp hạ bì của da bị quang hoá, các bó sợi collagen bị rối và bị phá hủy đi kèm với các sợi đàn hồi bị suy giảm nghiêm trọng. Theo đó, cơ chế chính của những thay đổi mô học bất thƣờng này là sự sản xuất quá mức của MMP, chẳng hạn nhƣ MMP- 1 và MMP-3. MMP-1 phá vỡ các sợi collagenvà elastin, trong khi MMP-3 làm suy giảm các sợi đàn hồi và các thành phần liên kết khác, do đó, làm mất khả năng đàn hồi của da [50]. MMP gia tăng quá mức là kết quả của sự tích lũy các ROS và phản ứng viêm. Cơ chế bảo vệ chống lại tác hại của ROS là hệ thống phòng thủ chống oxy hoá [51]. Enzyme chống oxy hoá nội tại có thể làm sạch ROS và bảo vệ các tế bào da. Mặc dù đã có các hệ thống chống oxy hoá hiệu quả trong da, nhƣng khi
lƣợng ROS quá mức tiết ra do tiếp xúc với tia UV vƣợt quá khả năng của hệ thống này đã kích thích gia tăng lƣợng MMP trong da và gây ra hiện tƣợng lão hoá da [52].
Một công bố khác của Bhattacharyya, T. K. và cộng sự (2017) khi nhuộm hoá mô miễn dịch cho collagen I cho thấy mật độ collagen I ở nhóm chiếu UVB cao hơn nhóm đối chứng (p < 0,01). Ngoài ra, chỉ số sợi đàn hồi cũng nhƣ lƣợng nguyên bào sợi ở nhóm chuột bị chiếu UVB cũng tăng hơn so với nhóm đối chứng (p < 0,02; p < 0,001; tƣơng ứng). Điều này càng chứng tỏ nhóm chuột bị chiếu UVB có hiện tƣợng lão hoá da [5]. Nhóm này cho rằng, dƣới tác dụng của UVB, khi lƣợng collagen I tăng cùng với sự tăng sợi đàn hồi và nguyên bào sợi có thể chứng tỏ sự tăng cƣờng hoạt động hoặc tăng sự bù đắp tổng hợp lƣợng collagen I trƣớc khi chúng bị vô hiệu hoá (xơ cứng). Lƣợng collagen I đƣợc tăng cƣờng hay giảm tổng hợp phụ thuộc vào thời gian và cƣờng độ chiếu tia UVB. Khi chiếu UVB vƣợt quá 10 tuần, nhƣng không quá 24 tuần, sự tổng hợp collagen I đƣợc tăng cƣờng để bù vào lƣợng collagen trƣởng thành ở lớp hạ bì hay đã bị mất do sự tác động của tia UV. Kết quả cuối cùng làm thoái hoá collagen với những nếp nhăn biểu hiện ra bề ngoài của da mà ta dễ dàng nhìn thấy [5, 53, 54].
Sự lão hoá da liên quan đến sự phá hủy các thành phần cấu trúc ngoại bào (ECM - Extracellular Matrix), đặc biệt là các sợi collagen. Trong khi cả hai yếu tố bên trong và bên ngoài đều liên quan đến hiện tƣợng phá hủy này, việc quang hoá bằng chiếu xạ UV có tác dụng đáng kể hơn nhiều so với các yếu tố khác và các cơ chế cơ bản đã đƣợc công bố rộng rãi trong nhiều nghiên cứu [55]. Cơ chế phân tử cơ bản của quang hoá bao gồm các quá trình: (1) Bƣớc đầu tiên là tạo ra ROS bằng chiếu xạ UV [56]; (2) Các thụ thể đƣợc kích hoạt kích thích các thành phần của các đƣờng dẫn tín hiệu rất phức tạp nối tiếp nhau trong nhân và tạo thành AP-1, yếu tố phiên mã kích thích sự phiên mã của gene MMP [57, 58]. MMP là gene có vai trò chính trong sự thay đổi và suy thoái của ECM, các phân tử mục tiêu chính là protein ECM bao gồm tất cả các loại collagens, elastin và proteoglycans [59]. MMP đƣợc sản xuất bởi keratinocytes biểu bì, nguyên bào sợi, trong trung gian của sự tái tạo ECM và phát sinh ung thƣ da [60-62]. Tỉ lệ MMP tăng theo sự lão hoá và tăng thêm bởi các chất ô nhiễm môi trƣờng và bức xạ UV, dẫn đến đứt gãy các sợi collagen và elastin gây lão hoá da, thậm chí có thể gây ung thƣ da [63, 64]. AP-1 cũng ức chế biểu hiện gene Procollagen bằng cách chặn thụ thể TGF-loại II/tín hiệu Smad [40]. Do đó, chiếu UV làm phát sinh tổn thƣơng da do sự thoái hoá collagen bằng cách
tăng biểu hiện của MMP, ức chế tổng hợp Procollagen cũng nhƣ giảm biểu hiện của các protein ECM cấu trúc.
Tóm lại, chiếu xạ UV trong thời gian dài (hoặc cƣờng độ cao) đã phá vỡ cấu trúc collagen dẫn đến sự lão hoá da với các biểu hiện nhƣ da nhăn nheo, chảy xệ và mất đi sự dàn hồi.
3.3. KẾT QUẢ KHẢO SÁT HIỆU QUẢ NGĂN NGỪA LÃO HOÁ DA CỦA DỊCH CHIẾT NHAU THAI HEO NỒNG ĐỘ 100 μg/mL CỦA DỊCH CHIẾT NHAU THAI HEO NỒNG ĐỘ 100 μg/mL
3.3.1.Kết quả ở mức đại thể
Tƣơng tự nhƣ thí nghiệm 2, trƣớc khi tiến hành chiếu UV để bố trí thí nghiệm 3, đặc điểm da chuột ở các nghiệm thức ban đầu đều đƣợc ghi nhận, kết quả cho thấy da chuột đều có những đặc điểm bên ngoài tƣơng đồng nhau: bề mặt da đồng nhất về cấu trúc, độ đàn hồi tốt, màu da đồng đều, bề mặt da căng, mịn và lông mỏng mịn, dễ cạo sạch lông.
Sau khi chiếu UV, kết quả cho thấy cấu trúc bên ngoài của da ở các nghiệm thức có những thay đổi so với thời điểm trƣớc khi tiến hành thí nghiệm. Sau 4 tuần thí nghiệm, ở nghiệm thức 1 (đối chứng), cấu trúc bên ngoài của da tƣơng đối mịn và vẫn chƣa thể hiện sự thay đổi bên ngoài so với thời điểm trƣớc khi thí nghiệm; ở nghiệm thức 2 (chiếu UV, không bôi gì cả), da chuột có nếp nhăn rõ ràng hơn so với thời điểm ban đầu và so với 3 nghiệm thức còn lại. Riêng nghiệm thức 3 và 4, kết quả chƣa thấy sự thay đổi so với thời điểm ban đầu.
Kết thúc 8 tuần chiếu UV, kết quả thể hiện rõ ràng thông qua quan sát tổng thể bên ngoài (hình 3.12) và mức độ cảm nhận sự đàn hồi của da.
Hình 3.12. Da chuột dƣới ảnh hƣởng của UV và hiệu quả ngăn ngừa lão hoá của
các sản phẩm sau 8 tuần chiếu ở các nghiệm thức
- Nghiệm thức đối chứng (không chiếu UV, không bôi bất kì sản phẩm nào): bề mặt da tƣơng đối mịn, có nếp nhăn nhẹ, toàn bộ vùng da có màu tƣơng đối hồng, sự đàn hồi tốt. Phần chân lông mềm, lớp lông mới mọc mềm mịn, dễ cạo và không để lại chân lông; mọc lông mới khá chậm, mỏng mịn, dễ cạo sạch, không để lại chân lông trên bề mặt da; da có cấu trúc ổn định và rất ít bị tổn thƣơng khi cạo, tốc độ phục hồi nhanh (hình 3.12 a).
- Nghiệm thức đối chứng âm (chiếu UV 6 giờ/ngày và không bôi bất kì sản phẩm nào): có kết quả tƣơng đồng nhƣ nghiệm thức 3 của thí nghiệm 2: màu da không đồng nhất, nếp nhăn xuất hiện nhiều, biểu bì bong tróc tạo lớp vảy mỏng trên da, da khô và dễ bị tổn thƣơng, chân lông cứng làm cho da thô ráp, lông mọc có xu hƣớng cứng hơn so với nghiệm thức đối chứng cùng thời điểm. Sự đàn hồi của da cũng lâu hơn so với nghiệm thức đối chứng và 2 nghiệm thức còn lại (hình 3.12 b).