Chỉ tiêu Đơn vị Kết quả
Alanine mg/100ml 32,22 Aspartic acid mg/100ml 27,34 Glutamic acid mg/100ml 91,61 Glycine mg/100ml 36,15 Histidine mg/100ml 17,19 Isoleucine mg/100ml 31,56 Leucine mg/100ml 41,15 Lysine mg/100ml 31,57 Methionine mg/100ml 19,25 Phenylalanine mg/100ml 18,29 Proline mg/100ml 24,47 Serine mg/100ml 34,04 Threonine mg/100ml 14,11 Tyrosine mg/100ml 21,43 Valine mg/100ml 41,96 Tổng mg/100ml 482,34
- Hàm lượng kim loại nặng trong dịch chiết nhau thai heo:
Dịch chiết nhau thai sau khi kiểm tra nồng độ amino acid đƣợc kiểm tra hàm lƣợng kim loại nặng để đảm bảo không gây ngộ độc tế bào và sức khỏe của con ngƣời (Bảng 3.2).
Bảng 3.2. Kết quả phân tích hàm lƣợng kim loại nặng trong dịch chiết nhau thai heo
Chỉ tiêu kiểm nghiệm Đơn vị tính Kết quả
As Mg/Kg 0,03
Cd Mg/Kg Không phát hiện
Hg Mg/Kg Không phát hiện
Pb Mg/Kg Không phát hiện
So sánh với Thông tƣ số 06/2011/TT-BYT quy định về Quản lý mỹ phẩm về mức As cho phép trong mỹ phẩm là 5 ppm. Dịch chiết hoàn toàn đáp ứng tiêu chuẩn an toàn, và đƣợc sử dụng để tiến hành các thí nghiệm.
3.1.1.3. Hình thái của ASC sau khi bổ sung dịch chiết nhau thai heo
Tế bào sau khi bổ sung dịch chiết nhau thai heo, sau 12 giờ đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi để kiểm tra hình thái. Quan sát thấy dƣới sự hiện diện của dịch chiết nhau thai heo, tế bào vẫn giữ hình dạng thoi dài đặc trƣng với một nhân giống với hình dạng của ASC trƣớc khi bổ sung dịch chiết. Sau những ngày nuôi cấy tiếp theo, không có sự thay đổi nào về hình thái tế bào. Hình dạng này của ASC không khác biệt với hình dạng của MSC thƣơng mại Điều đó chứng tỏ, sau một thời gian tiếp xúc với dịch chiết nhau thai heo thì ASC có khả năng tăng sinh mà không bị apotosis cũng nhƣ giữ đƣợc tính gốc.
Hình 3.3. Hình thái ASC trƣớc và sau khi bổ sung dịch chiết 12h
(Hình A: Tế bào ATMSC đối chứng, Hình B: tế bào ATMSC có bổ sung dịch chiết nhau thai heo sau 12h. Scale bar 200 µm)
3.1.1.4. Sự tăng sinh của ATMSC dưới tác dụng của dịch chiết nhau thai heo
Các tế bào ATMSCs đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng có bổ sung dịch chiết nhau thai ở các nồng độ 50 µg/mL, 100 µg/mL và 150 µg/mL. Số tế bào sẽ đƣợc khảo sát số lƣợng vào các ngày 1 đến ngày 10. Sau đó tính toán giá trị trung bình, sai số và so sánh sự khác biệt bằng thống kê T-test.
Hình 3.4. Biểu đồ đƣờng cong tăng trƣởng của tế bào ATMSCs dƣới tác động của dịch chiết nhau thai heo ở các nồng độ 50, 100, 150µg/mL)
Kết quả ở đồ thị 3.1 cho thấy sự tăng sinh của tế bào ở các nghiệm thức có sự khác biệt.
Nghiêm thức 1: đối chứng (màu xanh dƣơng)
Nghiệm thức 2: đối chứng dƣơng (màu tím)
Nghiệm thức 3: sử dụng dịch chiết ở nồng độ 50 µg/mL (màu xanh lá)
Nghiệm thức 4: sử dụng dịch chiết ở nồng độ 100 µg/mL (màu đỏ)
Nghiệm thức 5: sử dụng dịch chiết ở nồng độ 150 µg/mL (xanh biển)
Khi so với đối chứng, nghiệm thức 3 không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đối chứng. Tế bào đạt đỉnh ở ngày 8 là 5x104 tế bào và giảm số lƣợng tế bào từ ngày 9, ngày 10. Tuy nhiên, nghiệm thức 4 có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đối chứng âm (p < 0,05) và đối chứng dƣơng (p < 0,05). Tế bào tăng cực đại ở ngày 7 đạt 5.8x104 tế bào, còn đối chứng thì đạt 4,7x104 tế bào. Quan trọng, là tế bào duy trì sự tăng sinh đến tận ngày 9 và giảm nhẹ vào ngày 10. Ở nghiệm thức 5, tế bào tăng cực đại tại ngày 6 đạt 5,1x104 tế bào. Tuy nhiên, tế bào lại gỉảm mạnh ở ngày 8 và nhanh chóng giảm số lƣợng tế bào có ý nghĩa thống kê với đối chứng.
Nhƣ vậy, có thể thấy ở nghiệm thứ 4, khi có sử dụng dịch chiết ở nồng độ 100 µg/mL thì sự tăng sinh tế bào đạt tối ƣu.
3.1.2.Sự biểu hiện gene Col-IV của tế bào gốc trung mô từ mô mỡ ngƣời ngƣời
ATMSCs đƣợc nuôi trong đĩa đƣờng kính 35mm, khi đạt tới gần bão hoà, thì bổ sung dịch chiết nhau thai heo ở nồng độ 100 µg/ml vì đây là nồng độ tối ƣu để tăng sinh AT-MSC. Sau 24h, chúng tôi tiến hành phản ứng RT-PCR theo hƣớng dẫn của nhà cung cấp.
(A)
(B)
Hình 3.5. Kết quả biểu hiện gene Col-IV
-Actin
(A) (Cột màu trắng là ATMSCs, Cột màu đen là ATMSCs bổ sung dịch nhau thai heo ở nồng độ 100 µg/m); (B) Hình chụp kết quả điện di. Vạch đầu là ATMSC, vạch kế là
ATMSCs bổ sung dịch chiết nhau thai heo
Biểu hiện gene Col-IV có sự tăng nhẹ nhƣng không có sự khác biệt về mặt thống kê. Có thể cần khảo sát thêm ở các nồng độ khác và các mốc thời gian khác để phân tích sâu hơn về việc thay đổi mức độ biểu hiện gene.
3.1.3.Biện luận
Dịch chiết nhau thai heo có hiệu quả tăng sinh tế bào ATMSCs:
Vai trò của dịch chiết nhau thai heo đã đƣợc một số tác giả nghiên cứu trƣớc đây. Tiwary và cộng sự năm 2006, đã nghiên cứu về khả năng làm lành của dịch chiết nhau thai với kết quả là dịch chiết hỗ trợ hồi phục những vết thƣơng khó phục hồi nhờ có yếu tố tăng trƣởng biểu bì (EGF) [36]. Nghiên cứu của Sousa và cộng sự năm 2008 chỉ ra rằng nhau thai heo có bFGF (yếu tố tăng trƣởng nguyên bào sợi cơ bản) đây yếu tố tăng trƣởng quan trọng để tế bào tăng sinh. bFGF còn liên quan tới một số con đƣờng tín hiệu khác nhƣ PI3K-AKT, STAT. bFGF có vai trò quan trọng trong các mô trƣởng thành, vì nhân tố này có thể điều hoà chức năng trao đổi chất, sữa chửa tổn thƣơng mô, tái tạo mô và sự sống sót của tế bào [37].
Từ bảng 3.1 về thành phần acid amin của dịch chiết nhau thai heo và biểu đồ hình 3.4 về sự tăng sinh ATMSCs qua các nghiệm thức, có thể nhận thấy các nghiệm thức có bổ sung dịch chiết nhau thai heo đều có sự tăng sinh tế bào, có thể lý giải rằng dịch chiết nhau thai đã cung cấp không chỉ các thành phần acid amin cần cho sự tăng sinh tế bào mà còn là nguồn cung cấp các nhân tố tăng trƣởng, hormone tăng trƣởng khác ví dụ bFGF. Nhƣ vậy, việc sử dụng dịch chiết nhau thai heo tại nồng độ 100 µg/ml thích hợp cho khả năng tăng sinh tốt nhất cho tế bào gốc trung mô thu từ mô mỡ. Tuy nhiên, khi khảo sát biểu hiện gene Col-IV của ATMSCs với nồng độ tối ƣu chỉ có sự tăng nhẹ, không có sự khác biệt về mặt thống kê. Có thể cần khảo sát thêm ở các nồng độ khác và các mốc thời gian khác để phân tích sâu hơn về việc thay đổi mức độ biểu hiện gene.
3.2. KẾT QUẢ TẠO MÔ HÌNH CHUỘT LÃO HOÁ DA BỞI TIA UV 3.2.1.Ảnh hƣởng ở mức đại thể 3.2.1.Ảnh hƣởng ở mức đại thể
Trƣớc khi tiến hành chiếu UV để bố trí thí nghiệm, đặc điểm da chuột ở các nghiệm thức ban đầu đều có những đặc điểm bên ngoài tƣơng đồng nhau: bề mặt da
đồng nhất về cấu trúc, độ đàn hồi tốt, màu da đồng đều, bề mặt da căng, mịn và lông mỏng mịn, dễ cạo sạch lông (hình 3.6).
Hình 3.6. Chuột đƣợc cạo lông trƣớc khi chiếu UV
Sau khi chiếu UV, kết quả cho thấy cấu trúc bên ngoài của da ở các nghiệm thức thí nghiệm có những thay đổi so với thời điểm trƣớc khi thí nghiệm, đặc biệt là mốc thời gian bắt đầu từ tuần thứ 4 (sau 4 tuần chiếu). Ở nghiệm thức đối chứng (không chiếu UV): hình dạng và cấu trúc bên ngoài của da không thấy có sự thay đổi so với thời điểm trƣớc khi chiếu UV. Ở nghiệm thức 1 (chiếu UV 3 giờ) và 2 (chiếu UV 6 giờ) chƣa thấy có đặc điểm gì khác biệt so với nghiệm thức đối chứng. Riêng ở nghiệm thức 3 (chiếu UV 9 giờ) có sự xuất hiện các nếp nhăn nông và lớp biểu bì bong tróc ở một số chuột, chân lông cứng hơn, sự đàn hồi của da lâu hơn so với nghiệm thức đối chứng.
Kết thúc thí nghiệm (sau 8 tuần chiếu UV), kết quả thể hiện rõ ràng thông qua quan sát tổng thể bên ngoài (hình 3.7) và mức độ cảm nhận sự đàn hồi của da.
Hình 3.7. Da chuột dƣới ảnh hƣởng của UV sau 8 tuần chiếu ở các nghiệm thức
(a - đối chứng; b - 3 giờ; c - 6 giờ; d - 9 giờ)
Nghiệm thức đối chứng: bề mặt da nhẵn, mịn, không có nếp nhăn, toàn bộ vùng da có màu trắng hồng, sự đàn hồi tốt. Phần chân lông mềm, lớp lông mới mọc mềm mịn, dễ cạo và không để lại chân lông; mọc lông mới khá chậm, mỏng mịn, dễ cạo sạch, không để lại chân lông trên bề mặt da; da có cấu trúc ổn định và rất ít bị tổn thƣơng khi cạo, tốc độ phục hồi nhanh (hình 3.7 a).
Nghiệm thức 1 (chiếu UV 3 giờ/ngày): bề mặt da tƣơng đối nhẵn, có dấu hiệu khác biệt so với chuột ở nghiệm thức đối chứng; một số chuột xuất hiện nếp nhăn nông và khó nhận biết, khi chuột di chuyển có xuất hiện một số nếp nhăn nông nhƣng nhanh chóng trở lại trạng thái bình thƣờng, màu da trắng hồng và đều, sự đàn hồi tốt, rất ít tế bào bị bong tróc, tốc độ phục hồi nhanh, khá tƣơng đồng so với chuột đối chứng. Phần chân lông mềm, lớp lông mới mọc mềm mịn, dễ cạo và không để lại chân lông (hình 3.7 b).
Nghiệm thức 2 (6 giờ/ngày): màu da không đồng nhất, nhiều khu vực có màu trắng đục, bề mặt da xuất hiện khá nhiều nếp nhăn nông, khi chuột di chuyển các nếp nhăn trở nên sâu hơn và dễ nhận thấy bằng mắt thƣờng. Biểu bì bị bong tróc và tạo nên một lớp vảy mỏng màu trắng trên bề mặt da. Da khô và dễ bị tổn thƣơng, phần chân lông sau khi cạo trở nên cứng và tạo thành một lớp màu trắng đục, thô ráp trên bề mặt da. Lông mới mọc có xu hƣớng cứng và chắc hơn so với chuột ở nghiệm thức đối chứng và nghiệm thức 1 ở cùng thời điểm quan sát. Sự đàn hồi của da giảm (lâu hơn) so với nghiệm thức đối chứng và nghiệm thức 1, da mất một khoảng thời gian để phục hồi trạng thái ban đầu và có thể quan sát bằng mắt thƣờng (hình 3.7 c).
Nghiệm thức 3 (9 giờ/ngày): da khô rõ, biểu bì bong tróc, bề mặt da thô ráp và dễ tổn thƣơng, màu da không đồng đều, đa phần vùng lƣng bị cạo lông có màu trắng đục, rất ít vùng có màu da trắng hồng nhƣ nghiệm thức đối chứng. Bề mặt vùng da bị cạo xuất hiện các nếp nhăn sâu và nhiều hơn so với chuột ở nghiệm thức 2 và nếp nhăn trở nên sâu và rõ hơn khi chuột di chuyển. So với nghiệm thức 2, khả năng đàn hồi của da kém, chạm tay vào có cảm giác da nhão và phải mất nhiều thời gian hơn để trở lại trạng thái ban đầu. Phần chân lông sau khi cạo trở nên dày và cứng khó thao tác cho các lần tiếp theo. Lớp lông mới mọc thƣờng thô, cứng và khó cắt tỉa hơn so với lông của chuột đối chứng và nghiệm thức 1, 2 quan sát cùng thời điểm (hình 3.7 d).
3.2.2.Ảnh hƣởng cấu trúc vi thể của da
3.2.2.1. Độ dày biểu bì
Hình 3.8. Ảnh hƣởng của UV lên độ dày biểu bì chuột sau 8 tuần thí nghiệm (X40)
(a - đối chứng; b - 3 giờ; c - 6 giờ; d - 9 giờ)
Ảnh hƣởng của UV lên độ dày biểu bì chuột sau 8 tuần thí nghiệm ở mức vi thể (hình 3.8) có độ dày biểu bì đƣợc thể hiện mức độ tuyến tính ở biểu đồ (hình 3.9).
Hình 3.9. Biểu đồ thể hiện độ dày biểu bì dƣới tác động của UV sau 8 tuần chiếu
Từ biểu đồ hình 3.9 nhận thấy, độ dày biểu bì của chuột bị ảnh hƣởng rõ rệt dƣới tác dụng của các mốc thời gian chiếu UV. Cụ thể:
Ở nghiệm thức đối chứng (không chiếu UV), độ dày trung bình của biểu bì là 14,50 µm, độ dày biểu bì ở các nghiệm thức còn lại (1, 2 và 3) đều tăng lên và có sự cách biệt với độ tin cậy rất cao (p < 0,001) (xem phụ lục 3.1). Khi chiếu UV liên tục 3 giờ/ngày, độ dày biểu bì trung bình khoảng 18,17 µm (tăng 3,66 µm so với nghiệm thức đối chứng); chiếu liên tục 6 giờ/ngày, độ dày biểu bì khoảng 24,06 µm (tăng gấp gần 1,7 lần so với nghiệm thức đối chứng) và ở mốc chiếu 9 giờ/ngày biểu bì có độ dày lớn nhất, trung bình khoảng 25,87 µm (tăng gấp gần 1,8 lần so với nghiệm thức đối chứng). Tóm lại, độ dày biểu bì tăng dần theo ngƣỡng thời gian chiếu UV. Điều này có thể do cơ chế tự bảo vệ của da để chống lại sức nóng của tia UV. Tốc độ tăng không theo tuyến tính, nguyên nhân có thể do sự kích thích tác động từ mức UV càng cao có thể làm cho độ dày càng tăng để chống lại sức nóng từ tia UV, nhƣng khi đến ngƣỡng thì sự gia tăng này sẽ chậm lại và đƣợc duy trì.
3.2.2.2. Cấu trúc collagen
Sau khi nhuộm HE, mẫu da đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi nhận thấy cấu trúc collagen với 4 mức độ khác nhau một cách rõ rệt (hình 3.10).
Hình 3.10. Cấu trúc collagen ở các mức độ lão hoá dƣới tác động của UV (X40)
Số lƣợng mẫu bị lão hoá da dựa theo cấu trúc collagen dƣới ảnh hƣởng của thời gian chiếu tia UV đƣợc thể hiện qua biểu đồ hình 3.11.
Hình 3.11. Biểu đồ thể hiện số lƣợng mẫu bị lão hoá da dựa theo cấu trúc collagen dƣới tác động của UV
Từ kết quả số lƣợng mẫu ở từng mức độ lão hoá (xem phụ lục 3.2), quy đổi thành tỉ lệ (%) mức độ lão hoá dƣới ảnh hƣởng của cƣờng độ chiếu ở mỗi nghiệm thức theo phƣơng pháp ở mục 2.4.4, kết quả đƣợc thể hiện qua bảng 3.3.
Bảng 3.3. Tỉ lệ (%) mức độ lão hoá da dƣới ảnh hƣởng của mốc thời gian chiếu
Nghiệm thức Lão hoá mức 0 Lão hoá mức 1 Lão hoá mức 2 Lão hoá mức 3 Đối chứng 60,00% 40,00% 0,00% 0,00% Nghiệm thức 1 33,00% 47,00% 20,00% 0,00% Nghiệm thức 2 6,70% 33,30% 33,30% 26,70% Nghiệm thức 3 3,30% 20,00% 50,00% 26,70%
Từ kết quả biểu đồ hình 3.11 và bảng 3.3, kết quả đánh giá mức độ lão hoá ở các nghiệm thức thông qua cấu trúc collagen đƣợc mô tả tóm tắt nhƣ sau:
Ở nghiệm thức đối chứng (không chiếu UV): trong điều kiện ánh sáng trắng của phòng thí nghiệm (12 giờ sáng :12 giờ tối), sau 8 tuần chỉ có 60% không bị lão hoá da (mức 0), và vẫn có tới 40% chuột có dấu hiệu lão hoá da (mức 1). Nhƣ vậy, trong điều kiện nuôi bình thƣờng, quá trình lão hoá nội tại vẫn diễn ra theo chu trình sống tự nhiên của chuột (chiếm 40%). Kết quả nhuộm HE cho thấy xuất hiện một số đứt gãy trong cấu trúc collagen và mật độ collagen bắt đầu không liên tục. Tuy nhiên, ở nghiệm thức này không có lão hoá da mức 2 và 3; lão hoá mức 1 vẫn dƣới 50%. Kết quả này cho thấy chuột đƣợc nuôi trong điều kiện bình thƣờng, khi đạt 14 tuần tuổi, sự lão hoá do thay đổi cấu trúc collagen là không đáng kể. Điều này giúp cho sự đánh giá ảnh hƣởng của tia UV lên tốc độ lão hoá có tính tin cậy cao.
Ở nghiệm thức 1 (chiếu UV 3 giờ/ngày), kết quả thực nghiệm cho thấy có 33% chuột không bị lão hoá da, trong khi đó có tới 47% chuột bắt đầu có dấu hiệu lão hoá da (mức 1) và 20% chuột bị lão hoá da (mức 2), chƣa thấy mẫu nào có hiện tƣợng lão hoá da nhiều (mức 3). Sự xuất hiện lão hoá mức 2 ở thời gian chiếu UV 3 giờ/ngày có thể khẳng định rằng, việc chiếu tia UV có ảnh hƣởng đến cấu trúc collagen và làm biến đổi cấu trúc này, gây ra hiện tƣợng đứt gãy và mất sự liên kết giữa các sợi collagen với nhau.
Ở nghiệm thức 2 (chiếu UV 6 giờ/ngày), mức độ lão hoá thay đổi rõ rệt so với ở nghiệm thức chiếu 3 giờ/ngày: số lƣợng mẫu không bị lão hoá da (mức 0) chỉ có 6,7%; số lƣợng mẫu có dấu hiệu lão hoá da (mức 1 và mức 2) bằng nhau, đều chiếm 33,33% và đặc biệt, có tới 26,7% mẫu da bị lão hoá nặng (mức 3). Nhƣ vậy, với thời gian chiếu 6 giờ/ngày, chuột bị lão hoá da tăng so với khi chiếu 3 giờ/ngày (33,33% so 20%, tƣơng ứng); sự xuất hiện lão hoá da nặng với tỉ lệ 26,7% chứng tỏ thời gian tiếp xúc với tia UV lâu hơn đã gây ra hiện tƣợng đứt gãy hầu hết cấu trúc collagen ở nhiều mức độ khác nhau. Trong khi đó, với thời gian chiếu 3 giờ/ngày