Về bản chất thì sự phân hoá và phản phân hoá là một quá trình hoạt hoá phân hoá gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen đƣợc hoạt hoá để cho ra tính trạng mới, một số gen khác lại bị ức chế hoạt động. Quá trình này xảy ra theo một chƣơng trình đã đƣợc mã hóa trong cấu trúc của phân tử ADN của mỗi tế bào. Khi tách tế bào riêng rẽ, gặp điều kiện bất lợi thì các gen đƣợc hoạt hoá, quá trình phân chia sẽ đƣợc xảy ra theo một chƣơng trình đã định sẵn trong ADN của tế bào [26].
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô- tế bào thực chất là kết quả của quá trình phân hoá và phản phân hoá tế bào. Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào xét cho đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo và vô trùng) một cách định hƣớng dựa vào sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật. Để điều khiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, ngƣời ta thƣờng bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy hai nhóm chất điều tiết sinh trƣởng thực vật là Auxin và Cytokinin. Tỷ lệ hàm lƣợng hai nhóm chất này trong môi trƣờng khác nhau sẽ tạo ra sự phát sinh hình thái khác nhau. Trong môi trƣờng nuôi cấy có tỷ lệ nồng độ Auxin (IAA, IBA, NAA, 2,4-D)/Cytokinin (BAP, Kinetin, Zeatin, TDZ) thấp thì sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy theo hƣớng tạo chồi, ngƣợc lại nếu tỷ lệ cao thì mô nuôi cấy sẽ theo hƣớng tạo rễ còn ở tỷ lệ cân đối sẽ phát sinh theo hƣớng tạo mô sẹo (callus) [1].
Tế bào phôi sinh
Phân hóa tế bào
Tế bào chuyên hóa Tế bào giãn
1.3. CÁC NHÂN TỐ ẢNH HƢỞNG TỚI NHÂN GIỐNG BẰNG NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO CẤY MÔ TẾ BÀO
Nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào gồm nhiều giai đoạn kế tiếp nhau, quá trình này thƣờng bị ảnh hƣởng bởi các nhân tố sau:
1.3.1. Môi trƣờng nuôi cấy
1.3.1.1. Môi trường hóa học
Trong nuôi cấy in vitro, môi trƣờng và điều kiện nuôi cấy đƣợc coi là các yếu tố chính quyết định đến sự thành công của quá trình nuôi cấy. Môi trƣờng nuôi cấy chính là nguồn cung cấp các chất dinh dƣỡng cần thiết cho sự tăng trƣởng và phân hoá mô nuôi cấy in vitro. Môi trƣờng nuôi cấy bao gồm
thành phần sau:
+ Nguồn các bon: là nguồn cung cấp năng lƣợng chính cho các mẫu vật nuôi cấy. Do trong giai đoạn này chúng chƣa có khả năng quang hợp để tổng hợp nên chất hữu cơ phục vụ cho quá trình sinh trƣởng và phát triển của mình. Nguồn cácbon thƣờng đƣợc sử dụng là các loại đƣờng (chủ yếu là saccarose và glucose) với nồng độ khoảng 20-30 mg/l. Nó có tác dụng giúp mô tế bào thực vật tổng hợp các hợp chất hữu cơ, tăng sinh khối, ngoài ra nó còn đóng vai trò là chất thẩm thấu chính của môi trƣờng [27].
+ Nguồn Nitơ: Thông thƣờng, nguồn nitơ đƣợc đƣa vào môi trƣờng ở hai dạng là HN4+
và NO3- (nitrat) với tỷ lệ tuỳ thuộc vào loài cây và trạng thái phát triển mô. Qúa trình hấp thụ NO3-
của các tế bào thực vật có hiệu quả hơn so với NH4
+
[26].
+ Các nguyên tố đa lượng: Các nguyên tố này có chức năng cung cấp nguyên liệu để mô hoặc tế bào thực vật xây dựng thành phần cấu trúc hoặc giúp cho quá trình trao đổi chất giữa các tế bào thực vật với môi trƣờng đƣợc thuận lợi. Các nguyên tố đa lƣợng chính là những nguyên tố khoáng nhƣ: N, P, K, S, Mg, Ca…. Nhìn chung, các nguyên tố này đƣợc sử dụng ở nồng độ khá cao (trên 30 ppm) [26].
+ Nhóm nguyên tố vi lượng: gồm các nguyên tố Fe, Cu, BO, Zn, Mn,
Co, I… đây là các nguyên tố rất quan trọng và không thể thiếu cho sự phát triển của mô và tế bào do chúng đóng vai trò quan trọng trong các hoạt động của enzym. Chúng đƣợc dùng ở nồng độ thấp hơn nhiều so với các nguyên tố đa lƣợng để đảm bảo sinh trƣởng và phát triển bình thƣờng của cây [28].
+ Các vitamin: Mặc dù mẫu vật nuôi cấy mô có thể tự tổng hợp đƣợc
các Vitamin cần thiết cho quá trình sinh trƣởng và phát triển, nhƣng sự đáp ứng là chƣa đủ cho nhu cầu vì các mẫu đƣợc nuôi cấy mô thƣờng có sinh trƣởng nhanh nên nhu cầu về dinh dƣỡng là khá lớn. Các Vitamin B1 và B6 là những Vitamin cơ bản nhất thƣờng dùng trong môi trƣờng nuôi cấy với nồng độ thấp khoảng 0,1-1mg/l [29].
+ Dung dịch hữu cơ: có thành phần không xác định nhƣ nƣớc dừa, dịch chiết nấm men, cà rốt, chuối, khoai tây... đƣợc bổ sung vào môi trƣờng có tác dụng kích thích sinh trƣởng mô sẹo và các cơ quan. Nƣớc dừa đã đƣợc sử dụng vào nuôi cấy mô từ năm 1941 và đƣợc sử dụng khá rộng rãi trong các môi trƣờng nhân nhanh in vitro. Trong nƣớc dừa thƣờng chứa các axit amin, acid hữu cơ, đƣờng, ARN và ADN. Đặc biệt trong nƣớc dừa còn có chứa những hợp chất quan trọng cho nuôi cấy mô nhƣ: Myo Inositol, các hợp chất có hoạt tính Auxin, các Gluxit của Cytokinin [27].
+ Chất làm đông cứng môi trường (giá thể trong nuôi cấy): Agar
(thạch) là một loại Polysacharid của tảo có khả năng ngậm nƣớc khá cao 6- 12g/l. Độ thoáng khí của môi trƣờng thạch có ảnh hƣởng rõ rệt đến sinh trƣởng mô nuôi cấy. Trong nhân giống cho các đối tƣợng cây rừng, nồng độ thạch dao động trong khoảng 4-8g/l tuỳ thuộc mục tiêu và đối tƣợng nuôi cấy nuôi cấy [28].
+ Các chất điều hoà sinh trƣởng
Sinh trƣởng và phát triển của cây đƣợc đảm bảo bởi hai cơ chế sinh lý trái ngƣợc nhau, tác nhân kích thích và tác nhân ức chế. Việc cân bằng giữa các chất kích thích sinh trƣởng và các chất ức chế sinh trƣởng có ý nghĩa quyết định trong việc điều hòa sự sinh trƣởng của cây [29].
Các Phytohormon là những chất điều hòa sinh trƣởng lá các chất có bản chất hóa học khác rất khác nhau, nhƣng có cùng chức năng điều khiển sinh trƣởng và phát triển của thực vật. Chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh trƣởng và phát triển của thực vật nhƣ: phân chia, biệt hoá tế bào… ngoài ra còn có ảnh hƣởng đến quá trình lão hoá mô và nhiều quá trình khác. Các phytohormon thƣờng sử dụng cho nuôi cấy mô thuộc 3 nhóm: Auxin, Cytokinin và Giberillin. Chúng là yếu tố quan trọng nhất trong môi trƣờng quyết định đến sự thành công của kết quả nuôi cấy.
* Auxin: là một loại phytohormon có khả năng kích thích sự phân chia mạnh mẽ của tế bào, giúp cây phát triển chiều ngang và kích thích sự ra rễ ở thực vật nhƣng lại kìm hãm sự phát triển của chồi phụ. Nhóm này gồm có các chất chính là: IBA (3-Indol Butyric Acid), IAA (Indol Acetic Acid), NAA (Nathyl Acetic Acid) … trong nuôi cấy mô thực vật Auxin thƣờng đƣợc sử dụng để kích thích sự phân chia tế bào, biệt hoá rễ, hình thành mô sẹo, kìm hãm sự phát triển chồi và tạo ra các rễ phụ [1, 27].
* Cytokinin: đƣợc phát hiện sau GA và Auxin. Đây là một loại phytohormon có tác dụng thúc đẩy sự phân chia tế bào, tạo chồi, rễ phụ; làm chậm sự lão hóa của lá, tăng cƣờng các chất dinh dƣỡng về phía các bộ phận đang phát triển. Các cytokinin đƣợc bổ sung vào môi trƣờng chủ yếu để kích thích sự phân chia tế bào và quyết định sự phân hoá chồi bất định từ mô sẹo và cơ quan. Các hợp chất thƣờng sử dụng là: Kinetine (6- Furfuryl Amino Purine - C10H9N05), BAP (6-Benzyl Amino Purine), Zip (Izopentenyl Adenin), Zeatin… Trong các chất này thì Kenitin và BAP đƣợc sử dụng phổ biến nhất vì chúng có hoạt tính cao và giá thành rẻ. Ngƣời ta cũng chứng minh đƣợc tỉ lệ về hàm lƣợng auxin/cytokinin đóng vai trò quyết định trong việc phát sinh hình thái mô nuôi cấy. Để tạo rễ thì tỉ lệ này cần lớn hơn một, nếu nhỏ hơn 1 mô sẽ biệt hóa theo hƣớng tạo chồi. Còn nếu tỉ lệ auxin/cytokinin gần bằng 1 thì mẫu nuôi cây sẽ biệt hóa tạo mô sẹo [1, 27].
* Gibberellin: Nhóm này có khoảng 50 loại hormone khác nhau nhƣng quan trọng nhất là GA (Gibberellin Acid 3). GA có tác dụng kích thích nảy
GA3 còn có tác dụng phá ngủ của các phôi, ức chế tạo rễ phụ cũng nhƣ tạo chồi phụ [1, 27]. Ngoài ra, nó còn có tác dụng ảnh hƣởng đến sự ra hoa của một số thực vật và có tác dụng rút ngắn thời gian sinh trƣởng dinh dƣỡng của cây.
Ngoài ra, độ pH của môi trƣờng có ảnh hƣởng khá rõ nét tới khả năng hoà tan các chất khoáng trong môi trƣờng. Nếu pH thấp (<4,5) hoặc cao (>7,0) đều gây ức chế sinh trƣởng, phát triển của cây trong nuôi cấy in vitro. Nên việc xác định đƣợc độ pH ban đầu của môi trƣờng cho quá trình sinh trƣởng và phát triển của mô cấy là cần thiết. Độ pH thƣờng đƣợc sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật nói chung từ 5,6 - 6.
Các yếu tố khác cũng cần đƣợc chú ý khác trong nuôi cấy in vitro là: sự ổn định của môi trƣờng và khả năng hấp thụ chất dinh dƣỡng của cây.
1.3.1.2. Môi trường vật lý
Sự sinh trƣởng và phát triển của các tế bào, mô đƣợc điều khiển bởi sự kết hợp giữa điều kiện vật lý trong phòng và điều kiện dinh dƣỡng trong ống nghiệm. Trong nuôi cấy mô tế bào các yếu tố của môi trƣờng vật lý đƣợc quan tâm đó là ánh sáng, độ ẩm, nhiệt độ.
+ Ánh sáng: là yếu tố cần thiết cho sự phát triển và phát sinh hình thái của các mô nuôi cấy. Ánh sáng có ảnh hƣởng tới mẫu cấy thông qua thời gian chiếu sáng, cƣờng độ ánh sáng và chất lƣợng ánh sáng [27].
Chu kỳ chiếu sáng và thời gian chiếu sáng cũng phải phù hợp với đặc tính sinh vật học của loài cây và bộ phận nuôi cấy. Thời gian chiếu sáng biến động từ 8 − 12 h/ngày.
Bên cạnh thời gian chiếu sáng, cƣờng độ ánh sáng thì chất lƣợng ánh sáng cũng ảnh hƣởng khá rõ tới sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy. Ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so với ánh sáng trắng, còn ánh sáng xanh thì ức chế sự vƣơn cao của chồi nhƣng lại có ảnh hƣởng tốt tới sự sinh trƣởng của mô sẹo.
+ Độ ẩm: Trong các bình nuôi cấy thì độ ẩm tƣơng đối luôn bằng 100% nên ta không cần phải quan tâm nhiều đến độ ẩm khi nuôi cấy mô.
+ Nhiệt độ: là nhân tố có ảnh hƣởng rõ rệt đến sự phân chia tế bào và các quá trình trao đổi chất của mô nuôi cấy, đồng thời nó có ảnh hƣởng tới sự hoạt động của Auxin, do đó làm ảnh hƣởng đến khả năng ra rễ của cây mô. Theo kết quả nghiên cứu của Von Arnold (1982) thì nếu nhiệt độ ngày/đêm là 200C/150C hoặc 200
C/180C tỷ lệ ra rễ đạt đƣợc khoảng 33%, thậm chí còn thấp hơn [30]. Ở nhiệt độ trung bình thì hoạt động trao đổi chất tốt hơn. Còn ở nhiệt độ cao lại thích ra nhiều tế bào không có tổ chức. Trong nuôi cấy mô, nhiệt độ thƣờng đƣợc duy trì ổn định, ban ngày từ 25 - 300C và ban đêm từ 17- 200C.
1.3.2. Vật liệu nuôi cấy
Việc lựa chọn vật liệu nuôi cấy quyết định đến sự thành công của quá trình nhân giống in vitro. Về nguyên tắc thì mọi tế bào của các mô chuyên hoá đều có tính toàn năng, nghĩa là đều có thể nuôi cấy thành công. Tuy nhiên, thực tế nghiên cứu cho thấy các loài tế bào và các loại mô khác nhau có mức độ nuôi cấy thành công khác nhau. Một nguyên tắc cơ bản trong nuôi cấy mô tế bào là các tế bào làm vật liệu nuôi cấy càng non thì khả năng nuôi cấy thành công càng cao. Nhƣ vậy, tế bào và phôi non là triển vọng nhất, rồi đến các tế bào của đỉnh sinh trƣởng nhƣ: mô phân sinh đỉnh ngọn, đầu rễ, lá non, tƣợng tầng… sau đó là các tế bào sinh dục nhƣ noãn bào và tế bào hạt phấn ở giai đoạn non [1].
1.3.3. Điều kiện vô trùng
Đây là điều kiện cơ bản đầu tiên của quá trình nuôi cấy in vitro. Nếu
điều kiện này không đƣợc đảm bảo thì mẫu nuôi cấy hoặc môi trƣờng sẽ bị nhiễm, mô nuôi cấy sẽ bị chết, các thí nghiệm ở giai đoạn sau sẽ bị ngừng lại. Do đó, trong toàn bộ quá trình nuôi cấy in vitro cần đảm bảo điều kiện vô
trùng tuyệt đối. Muốn đảm bảo điều kiện vô trùng cần có phƣơng pháp khử trùng mẫu thích hợp, phƣơng tiện khử trùng hiện đại, buồng và bàn nuôi cấy vô trùng. Chọn đƣợc đúng phƣơng pháp khử trùng sẽ cho tỷ lệ sống cao, môi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp sẽ đạt tốc độ sinh trƣởng nhanh [29].
Nồi hấp tiệt trùng: sử dụng cho việc khử trùng môi trƣờng nuôi cấy, dụng cụ nuôi cấy bằng hơi nƣớc có áp suất và nhiệt độ cao (1,1 - 1,2 atm, 120 -1300C).
Tủ sấy: để sấy khô các dụng cụ thuỷ tinh và dụng cụ cấy
Dung dịch khử trùng: để khử trùng vật liệu đƣa vào nuôi cấy ngƣời ta thƣờng sử dụng các dung dịch nhƣ HgCl2 (Clorua thuỷ ngân), NaOCl (Hypoclorit Natri), Ca(OCl)2 (Hypoclorit Canxi), H2O2 (ôxi già)…cồn dùng để khử trùng mẫu sơ bộ và đốt các dụng cụ khi nuôi cấy.
Phễu lọc vô trùng: dùng để khử trùng các dung dịch, không khử trùng đƣợc ở nhiệt độ cao nhƣ dung dịch Enzym hoặc một số chất điều hoà sinh trƣởng. Hiện nay, ngƣời ta thƣờng sử dụng một hệ thống bơm khử trùng dung tích lớn để thanh trùng các dung dịch nuôi cấy khi nuôi cấy tế bào trần hay huyền phù tế bào.
Buồng vô trùng: nơi đặt bàn cấy cần kín gió, cao ráo, sạch sẽ. Buồng phải đƣợc tiệt trùng liên tục trƣớc và sau khi làm việc bằng Foocmon kết hợp chiếu đèn tử ngoại.
Bàn cấy vô trùng: Tốt nhất là sử dụng bàn cấy Laminair flow box. Thiết bị này làm việc theo nguyên tắc lọc không khí vô trùng qua màng và thổi không khí vô trùng về phía ngƣời ngồi thao tác.
1.3.4. Buồng nuôi cấy
Buồng cấy là nơi dùng để đặt các mẫu nuôi cấy. Buồng cấy cần phải đảm bảo các điều kiện:
- Nhiệt độ 25 – 270C.
- Ánh sáng đạt 2000 – 3000 lux.
1.4. NHỮNG VẤN ĐỀ TRONG NHÂN GIỐNG IN VITRO
1.4.1. Sự nhiễm mẫu
Nhiễm là vấn đề rất đƣợc quan tâm và dễ xảy ra trong nuôi cấy mô thực vật, gây hậu quả nghiêm trọng đến hiệu suất nuôi cấy. Một số nguồn gây nhiễm mẫu nhƣ mẫu cấy, thao tác trong quá trình cấy, môi trƣờng, dụng cụ và các thiết bị (màng lọc của tủ cấy, hệ thống thông khí trong phòng cấy)…
Để giảm khả năng nhiễm mẫu bằng cách:
- Có thể sử dụng một số chất kháng sinh (Amphostericin B, Gentamicin, Penicillin…) để diệt vi khuẩn và nấm.
- Sử dụng mô phân sinh đỉnh sinh trƣởng để nuôi cấy.
1.4.2. Tính bất định về mặt di truyền
Kỹ thuật nhân giống vô tính áp dụng với mục đích tạo quần thể cây trồng đồng nhất với số lƣợng lớn nhƣng phƣơng pháp cũng tạo ra những biến dị soma qua nuôi cấy mô sẹo… Tần số biến dị hoàn toàn khác nhau và không lặp lại. Nuôi cấy mô sẹo cho biến dị nhiều hơn nuôi cấy chồi đỉnh. Cây trồng bị biến dị tế bào soma qua nuôi cấy thƣờng là biến dị về chất lƣợng, số lƣợng và năng suất nhƣng biến dị này không di truyền [29]. Những nhân tố gây ra biến dị mẫu vật nuôi cấy mô gồm:
- Kiểu di truyền của mô nuôi cấy: các loài cây khác nhau có tỷ lệ đột biến khác nhau
- Số lần cấy chuyển: số lần cấy chuyển càng nhiều càng cho độ biến dị cao. Biến dị nhiễm sắc thể nhiều hơn khi nuôi cấy kéo dài. Số lần cấy chuyển ít và thời gian giữa hai lần cấy chuyển ngắn làm giảm sự biến dị.