Mục đích của giai đoạn này là tạo ra các chồi mới từ các mô nuôi cấy. Khi đã có nguồn nguyên liệu nuôi cấy, cần tiến hành lấy mẫu và xử lý trong những điều kiện vô trùng. Ngƣời ta thƣờng dùng một hoá chất nhƣ HgCl2, Ca(0Cl)2, Na0Cl, H202, để khử trùng mẫu cấy. Tuỳ thuộc vào từng loại vật liệu mà chọn hoá chất, nồng độ và thời gian khử trùng thích hợp. Về nguyên tắc, mô nuôi cấy có thể là bất kỳ bộ phận nào của cây (thân, rễ, lá, hoa, quả…) nhƣng theo Blatt thì mô lấy từ các phần non của cây có khả năng nuôi cấy thành công cao hơn mô lấy từ các bộ phận trƣởng thành khác [32]. Vì vậy, ngƣời ta thƣờng lấy chồi đỉnh hay chồi nách để nuôi cấy in vitro.
Ngoài ra, khi lựa chọn mô nuôi cấy cần chú ý tuổi sinh lý của mô càng thấp thì độ trẻ hoá cao, nuôi cấy dễ thành công. Các mô lấy ở thời kỳ sinh trƣởng mạnh của cây trong mùa sinh trƣởng cho khả năng tái sinh tốt hơn. Đối với mẫu dễ bị hoá nâu khi nuôi cấy có thể bổ sung than hoạt tính hoặc polyvinin pyrroline (PVP) vào môi trƣờng [19]. Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ mô nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trƣởng tốt. Kết quả của giai đoạn này phụ thuộc vào việc chọn bộ phận nuôi cấy, cho nên khi lấy mẫu cần đảm bảo các nguyên tắc nêu trên. Giai đoạn này thƣờng kéo dài từ 4 - 6 tuần.
1.5.3. Giai đoạn nhân nhanh
Một trong những ƣu điểm của phƣơng pháp nhân giống in vitro so với
các phƣơng pháp nhân giống khác có hệ số nhân cao. Vì vậy, có thể coi đây là giai đoạn then chốt của toàn bộ quá trình nhân giống. Hệ số nhân ở giai đoạn này biến động từ 5-50 lần tuỳ thuộc vào loài cây, môi trƣờng và điều kiện ngoại cảnh thích hợp. Trong giai đoạn này vai trò của các chất điều hoà sinh trƣởng (Auxin, Cytokinin) là cực kỳ quan trọng để sản sinh ra lƣợng cây con tối đa mà vẫn đảm bảo sức sống và bản chất di truyền của cây. Theo nguyên tắc chung thì môi trƣờng có nhiều Cytokinin sẽ kích thích tạo chồi. Chế độ nuôi thƣờng là ở nhiệt độ 25-270
C và 10-16h/ngày, cƣờng độ chiếu sáng 1.000-2.000lux. Yêu cầu của giai đoạn này là tạo ra số lƣợng cây con tối đa trong thời gian ngắn nhƣng vẫn đảm bảo sức sống và bản chất di truyền của cây.