CHƢƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.3.1. Tính tốn các chỉ tiêu theo dõi
Chiều cao trung bình của chồi (cm) =
Tổng chiều cao của chồi Tổng số chồi
Hệ số nhân chồi =
Tổng số chồi mới hình thành Tổng số chồi ban đầu
Tỷ lệ ra rễ (%) =
Tổng số chồi ra rễ
x 100 Tổng số chồi nuôi cấy
Chiều dài rễ trung bình (cm) =
Tổng chiều dài rễ Tổng số rễ
Tỷ lệ sống (%) =
Tổng số cây sống
x 100 Tổng số cây huấn luyện
2.3.3.2. Kiểm tra ảnh hưởng của các nhân tố đến kết quả thí nghiệm
- Kiểm tra ảnh hƣởng của các nhân tố thí nghiệm đến số rễ và chiều dài rễ bằng phƣơng pháp phân tích phƣơng sai.
+ Tính FA: FA= V V N A n a n . 1
Nếu FA < F0.5 tra bảng với bậc tự do k1 = a - 1 và k2 = n –a thì nhân tố
A tác động đồng đều lên kết quả thí nghiệm.
Nếu FA > F0.5 tra bảng với bậc tự do k1 = a - 1 và k2 = n - a thì nhân tố A tác động khơng đồng đều đến kết quả thí nghiệm. Khi đó, cơng thức thí nghiệm có ảnh hƣởng trội nhất đƣợc xác định thơng qua kết quả kiểm tra sai dị về trị số trung bình giữa hai cơng thức có trị số lớn nhất theo tiêu chuẩn của Student: t = j i n n S X X 1 1 ,, 2 max 1 max
Trong đó: S’’ =
a n
VN
là sai tiêu chuẩn ngẫu nhiên.
Ni và nj là dung lƣợng mẫu tƣơng ứng với cơng thức thí nghiệm có số trung bình lớn nhất và lớn thứ hai.
Nếu /t/ < t tra bảng với k = n – a, thì giả thiết Ho đƣợc chấp nhận, hay sai khác giữa hai trị số trung bình lớn thứ nhất và thứ hai là khơng rõ rệt, có thể chọn cơng thức thí nghiệm ứng với số trung bình lớn thứ nhất hoặc số trung bình lớn thứ hai.
Nếu /t / > t tra bảng với k = n – a, thì giả thiết Ho bị bác bỏ, hay có sai khác giữa hai trị số trung bình lớn thứ nhất và số trung bình lớn thứ hai vì thế chọn cơng thức thí nghiệm ứng với số trung bình lớn nhất có ảnh hƣởng trội nhất.
3. CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. XÁC ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG MẪU THÍCH HỢP CHO CÁC DỊNG KEO LAI NGHIÊN CỨU CÁC DÒNG KEO LAI NGHIÊN CỨU
Khử trùng mẫu là giai đoạn đầu của q trình ni cấy in vitro, có vai
trị quan trọng trong việc tạo nguồn vật liệu ban đầu cho các giai đoạn nuôi cấy tiếp theo. Hiện nay, phƣơng pháp hóa học đƣợc sử dụng phổ biến để khử trùng mẫu cấy. Những hóa chất có tác dụng diệt khuẩn đƣợc sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô tế bào thực vật nhƣ: HgCl2, NaClO, Ca(OCl)2, H2O2, AgNO3, các chất kháng sinh, … cũng có thể bổ sung thêm Tween 20, Tween 80, ... hoặc xử lý bằng cồn 700
để tăng độ xâm nhập và bám dính của các chất diệt khuẩn vào bề mặt mẫu cấy.
Kết quả thí nghiệm nghiên cứu ảnh hƣởng của loại hóa chất và thời gian đến kết quả khử trùng cho các dòng Keo lai đƣợc thể hiện tại Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả thí nghiệm khử trùng Keo lai
Hóa chất Thời gian (phút) CT Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) TLNCHH (%) HgCl2 0,05% 3 1 93,1±1,7 57,6±2,6 4,4±0,9 5 2 91,2±1,3 51,2±3,1 8,2±1,9 7 3 86,2±2,1 36,4±1,8 27,9±2,1 9 4 69,1±2,2 29,1±1,5 21,3±2,3 11 5 61,2±2,6 25,2±1,3 25,1±2,8
Hóa chất Thời gian (phút) CT Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) TLNCHH (%) HgCl2 0,1% 3 6 88,9±2,0 51,9±1,9 12,4±1,9 5 7 85,2±2,1 38,3±1,4 37,5±2,8 7 8 75,3±2,0 27,9±1,3 28,6±2,3 9 9 63,9±1,4 19,8±2,0 23,2±2,5 11 10 53,1±1,4 16,3±1,6 18,4±2,3 Ca(OCl) 2 5% 5 11 97,6±0,6 97,6±0,7 1,1±0,3 10 12 95,2±0,5 92,4±0,7 1,3±0,6 15 13 89,4±0,8 88,3±1,2 2,9±0,9 20 14 83,6±1,0 86,2±1,4 3,2±1,3 25 15 81,6±1,3 81,4±1,0 5,4±1,4 Ca(OCl) 2 10% 5 16 97,1±1,3 91,1±1,2 1,6±0,4 10 17 94,2±1,2 87,1±0,5 2,5±0,6 15 18 88,3±1,7 80,9±1,9 3,9±0,9 20 19 82,1±1,2 76,5±0,9 5,1±1,2 25 20 80,4±1,5 70,1±1,8 6,4±0,9 Ftính 22,90 71,84 6,22 Fbảng (.05; 19; 40) = 1,85
Đặc điểm mẫu vật ni cấy ở từng lồi là khác nhau, ngay cả trong lồi, trên cùng 1 cây mẹ, các vị trí lấy mẫu vật khác nhau đƣợc sử dụng nồng độ và thời gian khử trùng khác nhau cũng sẽ cho kết quả khác nhau. Do đó, cần lựa chọn nồng độ và thời gian khử trùng thích hợp để vừa đảm bảo tỷ lệ mẫu nhiễm thấp vừa đảm bảo tỷ lệ mẫu nảy chồi cao, và chồi tạo đƣợc có khả năng sinh trƣởng phát triển tốt. Nếu nồng độ hoá chất thấp và thời gian khử trùng chƣa đủ, các nguồn bụi bẩn, nấm bệnh, khuẩn, ... trên mẫu vật sẽ không thể đƣợc loại trừ hết; trái ngƣợc lại, nếu nồng độ hóa chất quá cao hoặc thời gian khử trùng quá dài, hóa chất sẽ ngấm sâu và phá vỡ cấu trúc tế bào, ảnh hƣởng đến sinh trƣởng, làm giảm khả năng tái sinh chồi.
Kết quả phân tích số liệu cho thấy: tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ mẫu nhiễm và tỷ lệ mẫu nảy chồi ở 20 cơng thức thí nghiệm với Keo lai đều có sự sai khác rõ rệt (Ftính > F.05).
Trong 2 loại hóa chất đƣợc sử dụng thì HgCl2 cho hiệu quả khử trùng
cao hơn hẳn so với Ca(OCl)2 (Bảng 3.1). Kết quả này cũng tƣơng tự nhƣ một số nghiên cứu trƣớc đây cho một số đối tƣợng cây rừng và các dòng Keo lai mới đƣợc tuyển chọn.
Sử dụng HgCl2 0,1% trong khoảng thời gian 5 phút đem lại hiệu quả
khử trùng tốt nhất (tiêu chuẩn Duncan). Cụ thể là: khi sử dụng HgCl2 0,1%
trong 5 phút thì tỷ lệ mẫu sống là 85,2%, tỷ lệ mẫu nhiễm là 38,3% và tỷ lệ nảy chồi hữu hiệu đạt tới 37,5%.
Nhƣ vậy, HgCl2 mặc dù có những hạn chế nhất định (có tính độc mạnh
cho con ngƣời và mơi trƣởng) nhƣng vẫn là chất rất thích hợp trong nghiên cứu khử trùng mẫu vật cho các giống cây rừng. Một số nghiên cứu gần đây cho thấy, sử dụng dung dịch Javen có thể là Phƣơng pháp thay thế mang tính an tồn hơn so với sử dụng thủy ngân trong việc khử trùng mẫu vật cho một số giống Keo và bạch đàn.
Giữa các giống khác nhau, hiệu quả khử trùng ở công thức tốt nhất cũng có sự sai khác rõ rệt. (Ftính > F.05) (Bảng 3.2). Trong 3 giống Keo lai nghiên cứu hiệu quả khử trùng tốt nhất ở giống BV376 với tỷ lệ nảy chồi hữu hiệu đạt 51,6%, trong khi tỷ lệ nhiễm chỉ là 35,9%. Mặc dù vậy, khi tiến hành sản xuất trên quy mô lớn, để tiết kiệm thời gian và chi phí việc sử dụng chung 1 công thức khử trùng cho cả 3 giống Keo lai nghiên cứu là hoàn toàn đáp ứng đƣợc yêu cầu của sản xuất mà vẫn đảm bảo đƣợc hiệu quả của quá trình khử trùng mẫu vật.
Bảng 3.2. Hiệu quả khử trùng của từng giống nghiên cứu
Dòng CT khử trùng tốt nhất Tỷ lệ nhiễm (%) TLNCHH (%) BV586 HgCl2 0,1% - 5 phút 31,7±1,2 44,2±1,5 BB055 HgCl2 0,1% - 5 phút 32,6±2,5 41,3±3,5 BV376 HgCl2 0,1% - 5 phút 35,9±0,6 51,6±1,7 Ftính 29,89 111,64 F05 tra bảng F (.05; 3; 8) = 4,06
Kết quả này tƣơng tự nhƣ các nghiên cứu trƣớc đây về nhân giống cho các dòng Keo lai tự nhiên BV71, BV73, BV75 trong nghiên cứu của Đoàn Thị Mai, Lê Sơn và cộng sự (2011) [4] cũng đã đƣợc khử trùng bằng HgCl2 nồng độ 0,1% với 8 - 10 phút cho tỷ lệ mẫu nhiễm thấp (chỉ từ 58,52 đến 72,59%) và tỷ lệ bật chồi khá cao (đạt từ 8,15 đến 11,11%). Tuy nhiên, ở một nghiên cứu khác, tác giả Girijashankar (2010) [6] lại sử dụng dung dịch sodium hypochlorite (NaOCl) 1,0% thêm một vài giọt Tween- 20 lắc trong 15 phút để đạt hiệu quả khử trùng tốt nhất cho các dòng Keo lai nghiên cứu.
Hình 3.1. Chồi bất định Keo lai dòng BB055 sau 25 ngày khử trùng
3.2. XÁC ĐỊNH MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY CƠ BẢN CHO KEO LAI Mơi trƣờng có vai trị quan trọng quyết định khả năng phân chia, phân Mơi trƣờng có vai trị quan trọng quyết định khả năng phân chia, phân hóa và hình thái của các mẫu cấy vì nó là nguồn cung cấp dinh dƣỡng duy nhất cho mẫu vật nuôi cấy. Việc xác định môi trƣờng nuôi cấy cơ bản là tiền đề để có thể thiết kế các thí nghiệm nhằm xác định mơi trƣờng nhân chồi, xác định môi trƣờng ra rễ cho các đối tƣợng nghiên cứu.
Thí nghiệm xác định mơi trƣờng ni cấy cơ bản cho các dòng Keo lai đƣợc tiến hành với 3 loại môi trƣờng khác nhau đó là: MS, MS1 (là môi trƣờng đã đƣợc sử dụng cho nhân chồi các dòng Keo lai tự nhiên trong các nghiên cứu trƣớc đây) [4]. Đây những môi trƣờng đã đƣợc sử dụng tƣơng đối rộng rãi cho nghiên cứu nhân giống cho cây rừng bằng nuôi cấy mô. Kết quả nhân chồi sau 30 ngày cấy thí nghiệm đƣợc trình bày trong Bảng 3.3.
Kết quả thí nghiệm cho thấy, mơi trƣờng MS1 đã đƣợc sử dụng để nuôi cấy các dịng Keo lai tự nhiên thành cơng trƣớc đây [4, 22, 33, 46, 47, 48] song lại không cho kết quả cao khi sử dụng để ni cấy các dịng Keo lai mới chọn tạo (Bảng 3.3). Trong các môi trƣờng đã thử nghiệm, mơi trƣờng MS2 là thích hợp nhất cho quá trình tái sinh trong nuôi cấy, từ đó mơi trƣờng này
đƣợc sử dụng để cấy khởi động nhằm tạo ra một số lƣợng chồi đủ lớn, sạch bệnh và tƣơng đối đồng đều về mặt sinh lý cho những thí nghiệm tiếp theo.
Bảng 3.3. Kết quả thí nghiệm xác định mơi trường ni cấy cơ bản
Mơi trƣờng Dịng BV376 Dịng BV586 Dòng BB055 HSNC Chiều dài chồi (cm) HSNC Chiều dài chồi (cm) HSNC Chiều dài chồi (cm) MS 2,3±0,8 2,7±1,2 3,1±1,2 3,1±0,9 2,2±1,0 2,8±1,1 MS1 2,5±0,6 3,1±1,1 2,6±1,1 2,7±1,0 2,4±1,1 3,1±1,1 MS2 3,3±0,7 3,2±0,9 3,7±1,2 3,4±1,1 3,4±1,2 3,5±1,1 Ftính = 5,34>Ftra bảng = 3,42
Khi sử dụng mơi trƣờng này, các đối tƣợng nghiên cứu có hệ số nhân chồi cao hơn sử dụng các loại mơi trƣờng cịn lại, đạt từ 3,3 đến 3,7 và chiều dài trung bình của chồi cũng đạt từ 3,2 đến 3,5cm. Các chồi mới tạo đƣợc khi ni cấy trong mơi trƣờng MS2 cũng có chất lƣợng khá tốt: thân chồi cứng cáp, lá phát triển. Điều này cho thấy các môi trƣờng đƣợc cải tiến dựa trên môi trƣờng MS cơ bản rất thích hợp cho ni cấy mơ Keo lai do có thành phần, tỷ lệ giữa các nguyên tố đa lƣợng, vi lƣợng và vitamin phù hợp cho sự sinh trƣởng và phát triển của Keo lai nói chung hơn là các mơi trƣờng khác [4]. Kết quả này một lần nữa cho thấy, đối với Keo lai nói chung, mỗi dịng lại có phản ứng khác nhau với mơi trƣờng ni cấy. Vì thế, các nghiên cứu xác định mơi trƣờng nhân giống thích hợp cho từng đối tƣợng nghiên cứu là cần thiết
Hình 3.2. Cụm chồi Keo lai dịng BB055 sau 25 ngày ni cấy trong các môi trường nhân chồi khác nhau (MS, MS1 và MS2 theo thứ tự từ trái
sang phải)
3.3. XÁC ĐỊNH MÔI TRƢỜNG NHÂN NHANH SỐ LƢỢNG CHỒI KEO LAI LAI
Để xác định mơi trƣờng nhân chồi thích hợp cho các đối tƣợng nghiên cứu, môi trƣờng MS đã đƣợc xác định ở thí nghiệm trên (ký hiệu là MS2 với Keo lai ) đƣợc sử dụng làm mơi trƣờng cơ bản cho các thí nghiệm tiếp theo. Để kích thích tạo chồi trong ni cấy mơ, các chất điều hoà sinh trƣởng hay đƣợc sử dụng là BAP và Kn. BAP và Kn là các chất điều hịa sinh trƣởng thuộc nhóm Cytokinin, có tác dụng kích thích q trình phân chia tế bào, duy trì sự sống của mơ, định hƣớng phân hóa tế bào và tăng khả năng tổng hợp diệp lục ở lá cây. Các loại chất này thƣờng đƣợc sử dụng để tạo cụm chồi trong nuôi cấy in vitro. Việc lựa chọn chất kích thích sinh trƣởng cũng nhƣ các nồng độ khác nhau để xác định mơi trƣờng nhân chồi thích hợp cho các đối tƣợng nghiên cứu trong khóa luận đƣợc thiết lập dựa trên các kết quả nghiên cứu về nhân giống cho Keo lai tự nhiên trƣớc đây của Nguyễn Ngọc Tân và cộng sự [47], Đoàn Thị Mai và cộng sự với các nồng độ 1,0mg/l; 1,5mg/l và 2,0mg/l [4]. Kết quả thí nghiệm xác
định ảnh hƣởng của BAP và Kn đến khả năng tạo chồi của các dịng Keo lai đƣợc trình bày tại Bảng 3.4 sau đây.
Bảng 3.4. Kết quả thí nghiệm xác định ảnh hưởng của BAP và Kn ở nồng độ khác nhau đến khả năng nhân chồi Keo lai sau 25 ngày nuôi cấy
Môi trƣờng MS2 + Ký hiệu Dòng BV376 Dòng BV586 Dòng BB055 HSNC Chiều dài chồi (cm) HSNC Chiều dài chồi (cm) HSNC Chiều dài chồi (cm) BAP 1,0 mg/l 1 3,9±1,2 3,5±1,1 4,5±1,3 3,5±1,1 3,8±1,2 3,9±1,3 BAP 1,5 mg/l 2 4,5±1,3 3,9±1,3 4,6±1,4 3,6±1,2 4,4±1,3 4,4±1,2 BAP 2,0 mg/l 3 4,2±1,1 3,6±1,2 4,8±1,3 3,5±1,1 3,9±1,2 4,3±1,2 Kn 1,0 mg/l 4 3,4±1,2 3,2±1,1 4,1±1,3 3,5±1,2 3,6±1,1 3,5±1,1 Kn 1,5 mg/l 5 3,7±1,2 3,4±1,3 4,3±1,2 3,6±1,1 3,8±1,2 3,7±1,2 Kn 2,0 mg/l 6 3,5±1,1 3,3±1,2 4,2±1,3 3,4±1,3 3,5±1,3 3,6±1,1 0 ĐC 3,3±0,7 3,2±0,9 3,7±1,2 3,4±1,1 3,4±1,2 3,5±1,1 Ftính=5,34 > Ftra bảng = 3,4
Kết quả thí nghiệm cho thấy, BAP có tác dụng rõ lên quá trình tạo chồi của các dịng Keo lai khi so sánh với cơng thức đối chứng (không sử dụng chất kích thích sinh trƣởng) hay khi sử dụng chất kích thích sinh trƣởng là Kn ở cùng nồng độ.
Môi trƣờng bổ sung BAP ở nồng độ 1,5mg/l có hệ số nhân chồi đạt đƣợc cao nhất là từ 4,4 đến 4,5 tuỳ thuộc vào các dịng thí nghiệm. Khi sử dụng cơng thức này, các chồi tạo đƣợc cũng có chiều cao trung bình cao hơn hẳn các cơng thức cịn lại (3,9-4,5cm). Mơi trƣờng đƣợc bổ sung BAP ở nồng
độ 2,0mg/l cũng cho hệ số nhân chồi tƣơng đối cao đối với dòng Keo lai BV586 (HSNC đạt 4,8) tuy nhiên chiều cao chồi thu lại chỉ đạt 3,5 cm (trong khi chỉ số này đạt 3,6cm khi nuôi cấy trong môi trƣờng bổ sung BAP nồng độ 1,5mg/l). Do đó, mơi trƣờng MS2 có bổ sung BAP nồng độ 1,5mg/l đƣợc chọn làm mơi trƣờng ni cấy chung cho cả 3 dịng Keo lai nghiên cứu. Kết quả này cũng tƣơng tự nhƣ trong các nghiên cứu trƣớc đây về nhân giống các dòng Keo lai, Keo lá tràm mới đƣợc chọn lọc [4, 46, 47,48] chính tỏ với Keo lai nói chung mơi trƣờng có bổ sung BAP nồng độ 1,5mg/l hoặc 2 mg/l là tƣơng đối phù hợp cho quá trình nhân chồi.
Hình 3.3. Các cụm chồi Keo lai được nuôi cấy trong các công thức môi trường nhân chồi khác nhau
3.4. XÁC ĐỊNH MÔI TRƢỜNG NÂNG CAO CHẤT LƢỢNG CHỒI CHO KEO LAI KEO LAI
Đối với Keo lai nói chung và Keo lai nói riêng, để chuẩn bị cho quá trình ra rễ cần phải nâng cao chất lƣợng chồi. Mục đích của giai đoạn này là tăng số lƣợng chồi có đủ tiêu chuẩn cho quá trình ra rễ, thông thƣờng môi trƣờng nuôi cấy sẽ đƣợc bổ sung thêm auxin ở các nồng độ khác nhau tuỳ thuộc vào đối tƣợng nghiên cứu.
Trong nhóm Auxin, NAA thƣờng đƣợc bổ sung thêm vào môi trƣờng nuôi cấy để tăng chất lƣợng chồi thu đƣợc đặc biệt cho Keo lai tự nhiên [1]. NAA có tác dụng làm tăng khả năng hô hấp của mô, tăng hoạt tính Enzim và ảnh hƣởng mạnh đến trao đổi Nitơ (N) và tiếp nhận các-bon trong môi trƣờng. Ở nồng độ thích hợp. NAA cịn có vai trị kích thích sinh trƣởng tế bào và kích thích tạo rễ.
Mơi trƣờng MS2 có bổ sung BAP nồng độ 1,5mg/l đã đƣợc xác định cho quá trình nhân nhanh số lƣợng chồi cho Keo lai. Tuy nhiên, khi sử dụng môi trƣờng này, tỷ lệ chồi hữu hiệu thu đƣợc cho quá trình ra rễ là chƣa cao, do đó để nâng cao chất lƣợng các chồi tạo đƣợc chuẩn bị cho ra rễ mơi trƣờng này cịn đƣợc bổ sung thêm NAA ở các nồng độ 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,25 và 1,5 gm/l. Số liệu thu thập sau 30 ngày ni cấy đƣợc trình bày tại Bảng 3.
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và NAA tới khả năng tạo cụm chồi Keo lai sau 25 ngày nuôi cấy
MS2 + BAP 1,5mg/l + NAA (mg/l) Ký hiệu Dòng BV376 Dòng BV586 Dòng BB055 HSNC Chiều dài chồi (cm) HSNC Chiều dài chồi (cm) HSNC Chiều dài chồi (cm) 0,25 N1 3,8±1,2 4,1±1,1 4,7±1,4 4,2±1,2 4,5±2,1 4,5±1,3 0,5 N2 5,5±2,3 5,8±1,9 5,1±2,1 5,2±1,5 4,9±1,2 5,5±1,4