CHƢƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.2. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm
Các nội dung thí nghiệm đƣợc tiến hành nhƣ sau:
* Nội dung 1: Xác định loại hóa chất và thời gian khử trùng thích hợp
cho các dịng Keo lai nghiên cứu
Thí nghiệm sử dụng loại hóa chất khử trùng là HgCl2 (ở 2 nồng độ
0,05% và 0,1%) và Ca(OCl)2 (ở nồng độ 5% và 10%). Thời gian khử trùng:
+ Đối với HgCl2: thời gian khử trùng 3, 5, 7, 9, 11 phút + Với Ca(OCl)2: thời gian khử trùng là 5, 10, 15, 20, 25 phút Thí nghiệm đƣợc bố trí với 3 lần lặp và 30 mẫu/lặp/cơng thức.
Chỉ tiêu theo dõi: số mẫu sống, số mẫu chết, số mẫu nhiễm, số mẫu nảy chồi.
* Nội dung 2: Xác định mơi trường ni cấy cơ bản cho các dịng Keo
lai nghiên cứu
Kế thừa các kết quả nghiên cứu về Keo lai trƣớc đây [4] môi trƣờng MS đƣợc chọn lọc là mơi trƣờng khống chất cơ bản để nuôi cấy cho các dịng keo lai. Các loại mơi trƣờng có sự thay đổi về tỷ lệ, thành phần các chất đa lƣợng, vi lƣợng dựa trên mơi trƣờng này đƣợc thí nghiệm, cụ thể nhƣ sau:
- Môi trƣờng MS cơ bản (MS): sử dụng môi trƣờng MS (Murashige and Skoog, 1962) và thành phần Vitamin của Morel
- Môi trƣờng MS cải tiến cho Keo lai (MS1) - Môi trƣờng MS cải tiến cho Keo lai (MS2)
Thí nghiệm đƣợc bố trí với 3 lần lặp và 30 mẫu/lặp/công thức. Chỉ tiêu theo dõi: số chồi/cụm, chiều cao chồi.
* Nội dung 3: Xác định môi trường nhân nhanh số lượng chồi Keo lai
Kế thừa các kết quả nghiên cứu về Keo lai trƣớc đây [4], 7 cơng thức thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của BAP và Kn đến khả năng nhân chồi các dịng Keo lai đƣợc bố trí nhƣ sau:
- Công thức 1: Đối chứng
- Công thức 2: MS cải tiến + 1.0 mg Kinetin/ lít - Công thức 3: MS cải tiến + 1.5 mg Kinetin/ lít - Cơng thức 4: MS cải tiến + 2.0 mg Kinetin/ lít - Cơng thức 5: MS cải tiến + 1.0 mg BAP/ lít - Công thức 6: MS cải tiến + 1.5 mg BAP/ lít - Cơng thức 7: MS cải tiến + 2.0 mg BAP/ lít
Thí nghiệm đƣợc bố trí với 3 lần lặp và 30 mẫu/lặp/cơng thức.
Chỉ tiêu theo dõi: số chồi/cụm, chiều cao chồi, số lƣợng chồi có chiều cao từ 2cm trở lên
* Nội dung 4: Xác định môi trường nâng cao chất lượng chồi cho Keo lai
Sau khi đã xác định đƣợc môi trƣờng tốt nhất trong trong nội dung 3, thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của sự phối hợp giữa Cytokinin và Auxin đến sự phát triển chồi của Keo lai đƣợc tiến hành với các công thức:
- Công thức 1: Đối chứng (Môi trƣờng MS*) - Cơng thức 2: MS* + 0,25 mg NAA/ lít - Cơng thức 3: MS* + 0.5 mg NAA/ lít - Cơng thức 4: MS* + 0,75 mg NAA/ lít - Cơng thức 5: MS* + 1,0 mg NAA/ lít
Thí nghiệm đƣợc bố trí với 3 lần lặp và 30 mẫu/lặp/công thức.
Chỉ tiêu theo dõi: số chồi/cụm, chiều cao chồi, số lƣợng chồi có chiều cao từ 2cm trở lên
* Nội dung 5: Tối ưu hóa Phương pháp ni cấy và chế độ chiếu sáng - Xác định chế độ chiếu sáng thích hợp
Thí nghiệm xác định chế độ ánh sáng thích hợp cho ni cấy mơ Keo lai đƣợc bố trí nhƣ sau:
+ Cơng thức 1 (đối chứng): Ni sáng 10-12h/ngày, trong 1 vịng cấy chuyển là 25 ngày bằng ánh sáng nhân tạo.
+ Công thức 2: Nuôi sáng 7-9h/ngày trong 1vòng cấy chuyển là 25 ngày bằng ánh sáng nhân tạo.
+ Công thức 3: Nuôi sáng 5h/ngày bằng ánh sáng tự nhiên, 5h/ngày bằng ánh sáng nhân tạo trong 25 ngày.
+ Công thức 4: Sử dụng 100% ánh sáng tự nhiên trong 25 ngày nuôi cấy.
- Xác định phƣơng pháp cấy thích hợp cho các dịng Keo lai
Để xác định phƣơng pháp cấy thích hợp cho các dịng Keo lai nghiên cứu, khóa luận đã tiến hành thí nghiệm với 3 cơng thức:
+ Công thức 1: Cấy các chồi đơn lẻ
+ Công thức 2: Cấy theo các cụm chồi, mỗi bình cấy từ 3-5 cụm chồi + Cơng thức 3: Cấy theo các cụm chồi, mỗi bình cấy từ 5 cụm chồi trở lên (mỗi cụm chồi có từ 3-5 chồi)
Thí nghiệm đƣợc bố trí với 3 lần lặp và 30 mẫu/lặp/cơng thức.
Chỉ tiêu theo dõi: số chồi/cụm, chiều cao chồi, số lƣợng chồi có chiều cao từ 2cm trở lên
* Nội dung 6: Xác định ảnh hưởng của IBA và NAA đến ra rễ của chồi Keo lai
Các chồi đủ tiêu chuẩn cao trên 2,0cm cứng cáp khoẻ mạnh đƣợc cấy vào môi trƣờng ra rễ là mơi trƣờng có1/2 thành phần của MSA* đƣợc bổ sung IBA hoặc NAA ở các nồng độ 0,5; 1,0; 1,5 và 2,0mg/l.
Thí nghiệm đƣợc bố trí với 3 lần lặp và 30 mẫu/lặp/công thức. Chỉ tiêu theo dõi: số ra rễ, chiều cao rễ, số rễ/chồi
* Nội dung 7: Xác định phương pháp huấn luyện cây có hiệu quả nhất
trước khi đưa cây mô ra vườn ươm
Chồi nuôi cấy mô sau khi ra rễ (5-7 ngày) đƣợc chuyển ra khu huấn luyện cho thích nghi dần với điều kiện tự nhiên. Để xác định thời gian huấn luyện thích hợp, cây đƣợc huấn luyện ở 5 công thức thời gian khác nhau:
- 0-3 ngày sau khi cây bắt đầu ra rễ - 4-6 này
- 7-10 ngày - 11-14 ngày
- 15-20 ngày
Thí nghiệm đƣợc bố trí với 3 lần lặp và 30 mẫu/lặp/công thức. Số liệu thu thập gồm: số cây sống, chiều cao cây
* Nội dung 8: Xác định loại giá thể phù hợp để cấy cây
Để xác đinh loại giá thể thích hợp cho cây ni cấy mơ, khóa luận đã tiến hành thí nghiệm với 5 loại giá thể khác nhau gồm:
- Cát sông - 100% đất màu
- 50% đất màu + 50% than trấu - 70% đất màu + 30% thanh trấu
- 70% đất màu + 20% than trấu + 10 xơ dừa
Thí nghiệm đƣợc bố trí với 3 lần lặp và 30 mẫu/lặp/công thức. Số liệu thu thập gồm: số cây sống, chiều cao cây